1-1- علل ناباروری در مردان.. 4

1-2- رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-1- تعریف و نحوه تشکیل رادیکال‌‌های آزاد. 5

1-2-2- نحوه عملکرد رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-3- گونه­ های فعال اکسیژن و نیتروژن.. 5

1-2-3-1- نقش­های بیولوژیک ROS.. 6

1-2-4- تولید و منبع رادیکال­های آزاد. 6

1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی.. 7

1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیت­ها 7

1-2-5- استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو. 9

1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA… 9

1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم. 11

1-2-6-2-استرس اکسیداتیو در اسپرم. 12

1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماری­های دیگر. 12

1-2-7- اثراتROS.. 13

1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم. 13

1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم. 13

1-2-8-  ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی.. 13

1-2-9-  ROS و ناباروری.. 14

1-2-10- آنتی اکسیدان­ها 15

1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتی­اکسیدان­ها به دو روش طبقه بندی میشود: 16

1-2-11- اثرات آنتی­اکسیدان­ها 18

1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18

1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیب­های بعد از انجماد اسپرم. 18

1-2-11-3- تاثیر آنتی­اکسیدان­ها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18

1-2-12- نقش آنتی­اکسیدان­ها (رباینده­های­بالقوهROS) دراسپرم. 19

3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20

1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21

1-4- اهداف: 22

1-5-فرضیات: 22

2-1-  مروری بر مطالعات علمی گذشته. 24

3-1- تعیین گروه­های آزمایشی.. 30

3-2- جمع آوری نمونه­ها و محل انجام آزمایش…. 30

3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31

3-4-  تک سلول کردن بافت بیضه. 31

3-5- شمارش تعداد سلول­های زنده در بافت بیضه. 32

3-6-1- روش فلوسایتومتری.. 32

3-6-2-  سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34

3-7- روش های تعیین آسیب DNA اسپرم. 35

3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست  DNAاسپرم. 36

3-7-2- جمع‌ آوری سلول‌های اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37

3-7-3-  محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39

3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39

3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40

. 40

3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41

3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42

3-8-3- تیمار کردن نمونه­های RNAی استخراج شده 43

3-8-4-  سنتزDNA  مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44

3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46

3-8-6-روش تهیه­ ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48

3-8-7- طرز تهیه­ محلول­ها 48

1- بافر50x TAE.. 48

2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48

3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49

مقایس­های برای کمی سازی نسبی.. 50

3-8-6- آنالیز آماری.. 52

4-1-  بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55

4-3- بررسی میزان ROS در بیضه­ی گروه کنترل و آزمون.. 56

56

4-4-  نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59

در بافت بیضه. 61

4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61

4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62

در بافت بیضه. 63

5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67

5-2- پیشنهادات: 70

فهرست جداول

عنوان                                                                              صفحه

جدول 1-1: انواع آنتی­اکسیدان­ها و مکانیسم عملکرد آنها 17

جدول 3-1: ترکیب محیط TCM…. 38

جدول 3-2: ترکیب محیط 38

جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40

جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونه­هایRNA… 43

جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45

جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45

جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47

جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکل­های هر مرحله. 47

جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش  Real-Time PCR… 51

جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51

جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونه­های بیضه­ای با بهره گرفتن از تکنیک فلوسایتومتری.. 58

جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60

.. 64

جدول 4-5: آنالیز نتایج  Real-Time PCR با بهره گرفتن از نرم افزار REST.. 64

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                                   صفحه

شکل 1-1: ارتباط بین  ATMو P53 در پاسخ­های ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو. 9

شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15

-MSH5.. 21

شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32

شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34

شکل 3-3: روش­های ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آن­ها 36

شکل3-4: اساس روش TUNEL.. 37

شکل 4-1: نمونه­های بافت بیضه در موش­های کنترل و آزمون.. 56

شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60

شکل 4-3: نمونه RNA­های استخراج شده از بافت بیضه. 62

63

شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65

فهرست نمودار

عنوان                                                                                                                                   صفحه

نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55

نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلول­های بیضه­ای در یکی از نمونه­های گروه کنترل و آزمون.. 57

) در نمونه­های بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون  59

نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونه­های اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون  61

. 65

چکیده

ناباروری عمده­ترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر می­ کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل می­باشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) می­توانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو می ­تواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژن­های دخیل در اسپرماتوژنز شود.

در این تحقیق با بهره گرفتن ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید  t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز  LD50برای  t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موش­های نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازه ­گیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژن Kdm5d  مورد ارزیابی قرار گرفت.

فلوسایتومتری افزایش استرس اکسیداتیو در موش­های گروه تیماری نسبت به گروه کنترل را نشان داد.  همچنین میزان شکست DNAدر موش­های گروه تیماری نسبت به گروه کنترل با آزمایش تانل به اثبات رسید. بیان ژن Kdm5d در گروه آزمون از طریق Real time PCR نشان داده شد. کاهش بیان ژن Kdm5d را می­توان به آسیب­های وارد شده به DNA و سایر مکانیزم­ ها از جمله تغییرات اپی­ژنتیکی که می­توانند در بیان ژن­ها تاثیرگذار باشند، نسبت داد.

کلمات کلیدی: ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو، ژنKdm5d

مقدمه :

ناباروری عمده­ترین مشکل مربوط به سلامت سیستم تولیدمثل در جهان است که حدود 15درصد زوج­های جوان را درگیر می­ کند. حدود 40% از ناباروری­ها مربوط به فاکتورهای مردانه است. این عارضه دلایل مختلفی از جمله واریکوسل، عفونت، ضایعات انسدادی، سیستیک فیبروزیس، تومورها و علت­های جدید همانند استرس اکسیداتیو دارد. استرس اکسیداتیو(OS) در نتیجه عدم تعادل بین گونه­ های اکسیژن فعال (ROS)و آنتی اکسیدان­ها در بدن می­باشد که می ­تواند از طریق اختلال در فرایند اسپرماتوژنز، عملکرد و ساختار اسپرم(بد­شکلی اسپرم، واکنش آکروزومی، آسیب به  DNAو عدم لقاح) منجر به ناباروری مردان شود. رادیکال­های آزاد و پراکسیدها ازمتابولیسم اکسیژن در تمام سلول­های هوازی سبب افزایش اکسیدان­ها در بدن می­شوند و می‌توانند با اكسایش تركیبات درون سلولی، به عملکرد و بقاء سلول­ها از جمله اسپرم­ها‌ آسیب برسانند. از عواملی که به­عنوان سد دفاعی سلول، در برابر استرس اکسیداتیو عمل می­ کنند آنتی­اکسیدان­ها هستند که به­صورت آنزیمی و غیر آنزیمی در سلول­های اسپرم و مایع منی وجود دارند. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d است.

فصل اول

کلیات

1- ناباروری

ناباروری[3]  یکی از مشکلات بالینی می­باشد که به دلیل شیوع و اهمیت آن، محققان روی این موضوع متمرکز شده ­اند(Comhaire, 1987). ناباروری در یک زوج بطورکلی به عنوان عدم توانایی برای بارداری بعد از یک سال مقاربت بدون جلوگیری تعریف می­ شود که حدود 15% از زوجین را در گیر می­سازد که 40% این ناباروری­ها مربوط به فاکتورهای مردانه می­باشد(Gnoth et al., 2005; Sharlip et al., 2002). ناباروری در مردان بوسیله آنالیز مایع منی[4] قابل تشخیص است. طبیعی بودن اسپرموگرام[5] – تست تشخیصی که غلظت، تحرک و ریخت­شناسی اسپرم­ها را اندازه ­گیری می­ کند –  عدم حضور سایر اختلالات را ثابت نمی­ کند(Poongothai, Gopenath, & Manonayaki, 2009). شواهد نشان می­ دهند که آسیب­های وارده به اسپرم بواسطه گونه­ های فعال اکسیژن (ROS) یکی از دلایل مهم ناباروری در 30-80 درصد موارد ناباروری مردان محسوب می­شوند(Agarwal, Prabakaran, & Allamaneni, 2006).

1-1-علل ناباروری در مردان