پایان نامه استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن (Kdm5d(Smcy

1- ناباروری.. 4

1-1- علل ناباروری در مردان.. 4

1-2- رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-1- تعریف و نحوه تشکیل رادیکال‌‌های آزاد. 5

1-2-2- نحوه عملکرد رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-3- گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن.. 5

1-2-3-1- نقشهای بیولوژیک ROS.. 6

1-2-4- تولید و منبع رادیکالهای آزاد. 6

1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی.. 7

1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیتها 7

1-2-5- استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو. 9

1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA… 9

1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم. 11

1-2-6-2-استرس اکسیداتیو در اسپرم. 12

1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماریهای دیگر. 12

1-2-7- اثراتROS.. 13

1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم. 13

1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم. 13

1-2-8- ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی.. 13

1-2-9- ROS و ناباروری.. 14

1-2-10- آنتی اکسیدانها 15

1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتیاکسیدانها به دو روش طبقه بندی میشود: 16

1-2-11- اثرات آنتیاکسیدانها 18

1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18

1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیبهای بعد از انجماد اسپرم. 18

1-2-11-3- تاثیر آنتیاکسیدانها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18

1-2-12- نقش آنتیاکسیدانها (ربایندههایبالقوهROS) دراسپرم. 19

3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20

1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21

1-4- اهداف: 22

1-5-فرضیات: 22

3-1- تعیین گروههای آزمایشی.. 30

3-2- جمع آوری نمونهها و محل انجام آزمایش…. 30

3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31

3-4- تک سلول کردن بافت بیضه. 31

3-5- شمارش تعداد سلولهای زنده در بافت بیضه. 32

3-6-1- روش فلوسایتومتری.. 32

3-6-2- سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34

3-7- روش های تعیین آسیب DNA اسپرم. 35

3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست DNAاسپرم. 36

3-7-2- جمع‌ آوری سلول‌های اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37

3-7-3- محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39

3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39

3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40

. 40

3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41

3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42

3-8-3- تیمار کردن نمونههای RNAی استخراج شده 43

3-8-4- سنتزDNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44

3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46

3-8-6-روش تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48

3-8-7- طرز تهیه محلولها 48

1- بافر50x TAE.. 48

2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48

3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49

مقایسهای برای کمی سازی نسبی.. 50

3-8-6- آنالیز آماری.. 52

4-1- بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55

4-3- بررسی میزان ROS در بیضهی گروه کنترل و آزمون.. 56

4-4- نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59

در بافت بیضه. 61

4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61

4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62

در بافت بیضه. 63

5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67

5-2- پیشنهادات: 70

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 1-1: انواع آنتیاکسیدانها و مکانیسم عملکرد آنها 17

جدول 3-1: ترکیب محیط TCM…. 38

جدول 3-2: ترکیب محیط 38

جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40

جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونههایRNA… 43

جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45

جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45

جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47

جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکلهای هر مرحله. 47

جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش Real-Time PCR… 51

جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51

جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونههای بیضهای با بهره گرفتن از تکنیک فلوسایتومتری.. 58

جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60

.. 64

جدول 4-5: آنالیز نتایج Real-Time PCR با بهره گرفتن از نرم افزار REST.. 64

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل 1-1: ارتباط بین ATMو P53 در پاسخهای ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو. 9

شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15

-MSH5.. 21

شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32

شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34

شکل 3-3: روشهای ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آنها 36

شکل3-4: اساس روش TUNEL.. 37

شکل 4-1: نمونههای بافت بیضه در موشهای کنترل و آزمون.. 56

شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60

شکل 4-3: نمونه RNAهای استخراج شده از بافت بیضه. 62

شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65

فهرست نمودار

عنوان صفحه

نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55

نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلولهای بیضهای در یکی از نمونههای گروه کنترل و آزمون.. 57

) در نمونههای بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون 59

نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونههای اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون 61

. 65

چکیده

ناباروری عمدهترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر می کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل میباشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) میتوانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو می تواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژنهای دخیل در اسپرماتوژنز شود.

در این تحقیق با بهره گرفتن ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز LD50برای t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موشهای نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازه گیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژن Kdm5d مورد ارزیابی قرار گرفت.

فلوسایتومتری افزایش استرس اکسیداتیو در موشهای گروه تیماری نسبت به گروه کنترل را نشان داد. همچنین میزان شکست DNAدر موشهای گروه تیماری نسبت به گروه کنترل با آزمایش تانل به اثبات رسید. بیان ژن Kdm5d در

موضوعات: بدون موضوع لینک ثابت

فرم در حال بارگذاری ...

فید نظر برای این مطلب