فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه وکلیات

1-1- مقدمه-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 2

2-1-کلیات تحقیق————– 3

1-2-1-دیابت-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 3

2-2-1- انواع دیابت————- 3

3-2-1- علائم بروز دیابت——– 4

4-2-1- درمان دیابت :———- 5

3-1- گیاه جغجغه (Prosopis farcta)————- 8

1-3-1- خواص دارویی جغجغه— 8

4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):—————- 9

5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :– 13

فصل دوم: مروری بر منابع

1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان— 16

1-1-2- انار-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 17

2-1-2-مكانیسم اثر انار در دیابت:—————- 17

2-1-2- سیر-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 19

2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن- 21

فصل سوم: مواد و روشها

1-3- موادو روشها————- 25

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—— 28

1-3-3- نحوه گروهبندی:——- 28

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:—————- 29

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———— 29

4-3-3- مراحل انجام تشریح:—- 29

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31

2-4-3- طراحی پرایمرها——- 35

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

5-3- استخراج RNA:———- 36

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 38

6-3- سنتز cDNA————

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—-

7-3- واکنش های PCR——–

1-7-3 – PCR شیب دمایی—– 41

2-7-3- PCR معمولی——— 43

8-3- الکترفورز————— 45

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

1-1-8-3- آگارز————– 45

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—— 46

3-1-8-3- لودینگ بافر——— 46

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl————-

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————–

9-3- روش کار با ژل الکترفورز— 47

10-3- رسم منحنی استاندارد:— 48

10-3- واکنش Real-Time PCR—————-

11-3- Threshold و مقدار CT:–

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———

10-2-3- آنالیز بیان ژن——– 52

 

 

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها—- 52

فصل چهارم: نتایج و بحث

1-4- جمع آوری نمونه :——– 54

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه——- 54

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 56

5-4- نتایج استخراج RNA:—–

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 59

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 61

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——– 61

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP—————

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————-

9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR————-

1-9-4- تکثیر ژنPFK———

2-9-4-تکثیر ژن TBP———

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:—— 66

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———–

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————-

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————–

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP—————

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 70

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70

15-4- بحث:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 71

16-4- پیشنهادات————- 73

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

چکیده:

دیابت قندی یكی از مشكلات مهم پزشكی در همه كشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل­های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی كه داروهای شیمیایی ممكن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد كنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می­توان راه­های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم.

در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش­های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه ­گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروه ها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد.

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه

دیابت یک بیماری ساده نیست، بلکه سندرم پیچیده­ای است که بارزترین ویژگی آن افزایش قند خون است. بنابراین، بیماران دیابتی هر چند در یک ویژگی به هم می­مانند، اما هم از نظر بالینی و هم از نظر آسیب شناسی و ژنتیکی ناهمگون هستند. این بیماری در سال 1980 میلادی این گونه تعریف شد: گروهی از نارسایی­ها که ویژگی اصلی آن­ها افزایش بیش از اندازه­ گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پیامد کمبود انسولین یا نارسایی در کارکرد انسولین و یا آمیزه­ای از این دو است. عوارض ناشی از دیابت در 25% موارد، نارسایی کلیه و در 50% موارد قطع عضو و نابینایی است (Tehranipour et al., 2008). گیاهان دارویی از قدیم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزایش کیفیت و طول زندگی در افراد دیابتی به کار گرفته شده است. با توجه به این که گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی اثر جانبی کمتری دارند، بنابراین پژوهشگران به دنبال یافتن ترکیبهای گیاهی برای درمان و یا پیشگیری از این بیماری هستند. گیاه جغجغه (Prosopis farcta) گیاهی با خواص ضد التهاب و ضد دیابتی است. اهمیت فعالیت فسفوفروکتوکیناز 1 نه تنها از این جنبه است که واکنشی به شدت انرژی زا را کنترل می کند بلکه اولین مرحله در واکنش­های گلیکولایزیز است که واکنش یکطرفه بوده و برگشت ناپذیر است. این باعث می­گردد که کنترل شدیدی بر روی میزان گلوکز و دیگر مونوساکاریدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آید.. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر میزان بیان ژن پیروات کیناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌های صحرایی نر دیابتی می‌باشد.

2-1- کلیات تحقیق

1-2-1- دیابت

دیابت ملیتوس شامل بیماریهای متابولیکی است که مشخصه آن افزایش مزمن قند خون و اختلالات متابولیسم کربوهیدرات­ها، چربی­ها و پروتئین­ها می باشد. این بیماری در نتیجه­ وجود نقص در ترشح انسولین، عملکرد انسولین یا هر دو ایجاد می­گردد. افزایش مزمن قند خون در حالت ناشتا یا بعد از خوردن غذا مسئول عمده­ی  عوارض کوتاه اثر و بلند مدت این بیماری می باشد که تمام سیستم­ها و اندام­های بدن را تحت تاثیر قرار میدهند. این بیماری شایعترین علت بیماریهای کلیوی مرحله نهایی، موارد جدید نابینایی و قطع اندام تحتانی غیرترومایی را به خود اختصاص می­دهد. بیماری قلبی عروقی در افراد دیابتی 2 تا 4 برابر نسبت به افراد عادی شایعتر  است و در افراد بالاتر از 25 سال 18٪ تمام بیماری­ها را شامل می­ گردد.

2-2-1- انواع دیابت

   دیابت به دو دسته­ی اصلی وابسته به انسولین (دیابت نوع 1) و دیابت غیر وابسته به انسولین (دیابت نوع 2) تقسیم می­ شود. همچنین گونه دیگر با نام دیابت بارداری (Gestational) که در دوران بارداری بروز کرده و پس از آن بهبود می یابد.

در دیابت نوع 1  که از انواع شایع بیماریهای  خود ایمن  است سیستم ایمنی بدن سلول­هایβ سازنده انسولین در پانکراس را تخریب می­ کند. این نوع دیابت بسیار سریعتر از سایر فرم­های دیابت پیشرفت می­ کند و معمولا در کودکان و نوجوانان بالغ، بعضی اوقات در جوانان بالغ دیده می­ شود. این بیماران باید بطور منظم انسولین تزریق کنند. همچنین به این دیابت، دیابت جوانان یا دیابت ملیتوس وابسته به انسولین نیز می­گویند. اما این اصطلاح نمی­تواند کاملا دقیق باشد برای اینکه این کودکان می­توانند به سایر فرم­های دیابت مبتلا شوند. یک فرم دیگر از دیابت نوع 1 که در سنین بالا معمولا بعد از سی سالگی رخ می­دهد LADAگفته می­شود. افراد مبتلا به این نوع دیابت فاقد شاخص­های ایمونولوژیکی هستند که حاکی از روند تخریب خود ایمنی سلول­های β باشد با  این وجود این بیماران بواسطه­ مکانیسم­های نامشخصی دچار کمبود انسولین می­شوند. گاهی اوقات بیماران مبتلا به دیابت اتوایمیون به دلیل افزایش وزن و فاکتورهای ژنتیکی به انسولین مقاوم می­شوند به این شرایط دیابت مضاعفگفته می­شود.

فاکتورهای قابل کنترلی مانند شیوه زندگی ناسالم، پرخوری، کم تحرکی، چاقی، می­توانند توانایی بدن را در استفاده از انسولین مختل کنند. همچنین فاکتورهای غیر قابل کنترلی مانند ژنتیک، تاریخچه­ی خانوادگی دیابتی، سن نیز در این فرایند درگیرند. فرم­های متابولیک دیابت شامل دیابت بارداری و دیابت نوع 2 می­باشند. بیماری دیابت بارداری، فرم موقت دیابت است و در دوران بارداری در هر زن غیردیابتی می ­تواند رخ دهد. تغییرات هورمونی، همراه با وزن زیاد و تاریچه خانوادگی دیابتی در ابتلا به این بیماری نقش دارند. بر اساس گزارش موسسه آمریکایی دیابت حدود 4% از زنان در طول دوران بارداری به این فرم از دیابت مبتلا می­شوند. این بیماری می ­تواند مشکلاتی مانند تولد جنین نارس، یرقان و مشکلات تنفسی برای مادر و کودک ایجاد کند. این بیماری بعد از زایمان بهبود می­یابد ولی مادر و کودک در سنین بالاتر استعداد ابتلا به دیابت نوع 2 را دارند (Riaz, 2009). دیابت نوع 2 شایعترین نوع دیابت بوده و90٪ موارد بیماری دیابت را به خود اختصاص داده است. شیوع دیابت نوع 2 پیوسته در حال افزایش است و میزان بروز دیابت نوع 2 در کودکان تقریبا ده برابر شده است.

1-2-3- علائم بروز دیابت

علایم بروز دیابت، به نوع دیابت و اینکه فرایند بیماری در چه مرحله­ ای باشد بستگی دارد. مبتلابان به دیابت نوع 1 معمولا با علایم حاد کلاسیک هیپرگلیسمی شامل: پرنوشی، پرادراری، کاهش وزن و به میزان کمتر پرخوری، تاری دید و خارش مراجعه می­ کنند. در بیست و پنج درصد مبتلایان نشانه بروز بیماری برای اولین بار کتواسیدوز دیابتی است. در مبتلایان به دیابت نوع 2 اغلب چندین سال قبل از تشخیص بیماری وجود دارد. معمولا علائم نسبت به نوع 1 کمتر به صورت حاد بروز می­ کند و ممکن است در افراد مسن­تر همراه با لتارژی و خستگی دیده شود. افزایش مزمن قند خون ممکن است با اختلال رشد، حساس بودن به عفونتها و ترمیم تاخیری زخم همراه می­باشد.

برخلاف بیماری­های تک ژنی، بروز بیماری توسط آلل موتانت در یک جایگاه ژنی تحت تاثیر قرار می­گیرد، در بیماری­هایی شبیه به دیابت نوع 2 بروز بیماری به چندین جایگاه ژنی که دارای اثر کوچک تا متوسط هستند، بستگی دارد. دیابت نوع 2، بیماری چند عاملی است که در آن ژنها نه تنها با یکدیگر، بلکه با عوامل محیطی نیز در تعامل اند. این احتمال وجود دارد که فعالیت و ترشح انسولین هر دو تحت کنترل واریانت­های ژنتیکی در جایگاه­های ژنی مختلف باشند. براساس مدل مولتی فاکتوریال، استعداد ابتلا به بیماری می ­تواند به وسیله­ ترکیبی از واریانت­های ژنتیکی متعدد و فاکتورهای محیطی تعیین شود. استعداد ژنتیکی افراد لزوما باعث سندروم آشکار نمی­ شود مگر اینکه آنها در معرض عوامل محیطی ویژه­ای قرار گیرند.

1-2-4- درمان دیابت

کمیته متخصصین سازمان بهداشت جهانی در سال 1980 توصیه کرده است که روش­های سنتی درمان دیابت، بیشتر مورد بررسی قرار گیرند، زیرا مرگ ناشی از دیابت در حال افزایش بوده و همچنین مشکلاتی در استفاده از داروهای رایج فعلی وجود دارد (Suba et al., 2004).  به طور سنتی در طول تاریخ از گیاهان متفاوتی برای کاهش قندخون و بهبود اثرات دیابت، استفاده شده و در طب سنتی ایران و سایر کشورهای جهان، اطلاعات کمابیش مفصلی در این رابطه به چشم می­خورد. داروهای گیاهی به خاطر کم بودن اثرات جانبی، در دسترس بودن، هزینه نسبتا کم و مؤثر بودن­ آنها، به طور وسیع در سرتاسر جهان مورد تجویز واقع می­شوند (Venkates et al., 2003).

چندین نوع داروی کاهش دهنده گلوکز وجود دارد که از طریق مکانیزم­ های مختلف، اثرات ضد­دیابتی خود را اعمال می­ کنند. از جمله این مکانیسم­ها می­توان به تحریک ترشح انسولین توسط داروهای خانواده سولفونیل اوره و مگلیتینیدها (Meglitinides)، افزایش جذب محیطی گلوکز توسط بای­گوانیدها (Biguanides) و تیازولیدین­دیون­ها (Thiazolidinediones)، به تأخیر انداختن جذب کربوهیدرات­ها از روده توسط مهارکننده­ های آلفا_ گلوکوزیداز، کاهش گلوکونئوژنز کبدی توسط بای­گوانیدها و تیازولیدین­دیون­ها (Modi, 2007)، افزایش غلظت سرمی GLP-1 و کاهش خالی شدن معده توسط آنالوگ­های پپتیدی جدید مانند اگزناتیدها (Exenatide) و لیراگلوتیدها (Liraglutide) و مهارکننده­ های DPP-4 اشاره کرد (Hui et al., 2005). این درمان­ها دارای معایبی نظیر توسعه­ مقاومت دارویی، اثرات جانبی و حتی سمی بودن تا کمبود پاسخ­دهی می­باشند. به عنوان مثال سولفونیل اوره­ها در مدت 6 سال کارایی خود را در 44 درصد بیماران از دست می­دهند. 3/2 از داروهای تجویز شده برای کودکان مؤثر نیستند ( Michal et al., 2005 and Defronzo, 1999). به علاوه هیچ کدام از این داروهای کاهش دهنده گلوکز به طور مؤثر افزایش لیپیدهای خون را کنترل نمی­ کنند (Derek, 2001). با شیوع در حال افزایش دیابت در جمعیت روستایی و به علت اثرات نامساعد داروهای صناعی، یک نیاز آشکار برای توسعه­ منابع گیاهی طبیعی برای داروهای ضد دیابت وجود دارد (Venkatesh et al., 2003). همچنین اثرات جانبی داروها و تداخلات آنها با یکدیگر که در بدن انسان یا در هنگام آزمایش­های مختلف آشکار می­ شود نیز مسأله مهمی است که باید مدنظر باشد (Bathaie et al., 2001). مواد مؤثر موجود در گیاهان دارویی مختلف، از طریق مکانیزم­ های متفاوتی قادر به کاهش قند خون هستند. عمده­ی این مکانیزم­ ها عبارتند از: افزایش ترشح انسولین، فعال کردن مسیر کاتابولیسم گلوکز، مهار یا غیر فعال کردن مسیر گلوکونئوژنز، هدایت گلوکز به داخل سلول، جذب گلوکز آزاد و ممانعت از اتصال آن به پروتئین­ها، افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانی و ممانعت از آسیب­زایی اکسیدان­های تولید شده در مسیرهای مختلف که ممکن است ناشی از ازدیاد گلوکز و تولید محصولات نهایی گلیکه یا سایر مسیرهای متابولیک باشد و سرانجام ممانعت از جذب گلوکز از روده. (بطحایی و همکاران، 1391). یکی از مهمترین مسائل مورد توجه در علوم پزشکی و حتی تجارت جهانی به تولید، فرآوری و استفاده از گیاهان دارویی می­باشد (Pirzad et al., 2006).  به ­طوریکه بعد از اسلحه سازی دومین صنعت پول ساز بزرگ جهان تولید و تجارت داروئی می­باشد (Riazi,1997).در سال 2008 سرمایه در گردش بازار جهانی گیاهان دارویی تا سال 2005 بالغ بر 5 تریلیون دلار گردد (امید بیگی، 1379). چین سالانه 8 میلیارد دلار از تولید گیاهان دارویی در­آمد کسب می­ کند. در ایران با وجود حجم عظیم منابع گیاهان دارویی، بخشی از نیاز جامعه از کشورهایی مثل هند وارد می­ شود (افشار، 1385). در حال حاضر سطح زیرکشت گیاهان دارویی در ایران 91 هزار هکتار و میزان تولید این محصولات 100 هزار تن است. صادرات گیاهان دارویی ایران در سال 1384 کمتر از 40 میلیون دلار بود (افشار، 1385). در حالیکه در سال 1387حجم مبادلات دارویی ایران به 89 میلیون دلار رسید (زمانی و همکاران، 1387). بشر همواره جهت رفع نارسائی­ها و بیماریهای خود نیاز به استفاده از داروهای طبیعی داشته و دارد. اهمیت تولید و فرآوری گیاهان دارویی بدلیل عوارض جانبی کمتر، عدم توانایی در تولید برخی داروها و همچنین هزینه بالای تولید بسیاری از مواد دارویی، روز به روز در حال افزایش است و بیشتر کشورها سرمایه گذاری زیادی را در راستای تولید گیاهان دارویی انجام داده­اند (letchamo, 2006). در حال حاضر یک

فهرست مطالب:

خلاصه فارسی…………………………………………………………………………………..1

مقدمه……………………………………………………………………………………………2  

فصل اول:کلیات

1-1) طرح موضوع………………………………………………………………………………..5

1-2) بیان مسأله…………………………………………………………………………………5

1-3) ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………8

1-4) هدف پژوهش………………………………………………………………………………8

1-5) سؤالات و فرضیه ها……………………………………………………………………….8

1-6) تعریف آنتی بیوتیک……………………………………………………………………..10

1-7) تاریخچه آنتی بیوتیک………………………………………………………………….11

1-8) اهمیت اقتصادی آنتی بیوتیک ها…………………………………………………….12

1-9) گروه های تولید کننده آنتی بیوتیک ها………………………………………………13

1-10) معرفی و بیان ویژگی های Saccharopolyspora erythraea …………………..

1-11) طبقه بندی آنتی بیوتیک ها………………………………………………………….15

1-11-1) طبقه بندی بر اساس منبع بیولوژیک……………………………………………..15

1-11-2) طبقه بندی بر اساس ساختار شیمیایی………………………………………..16

1-11-3) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………..17

1-12) مواردکاربرد آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………..24

1-13) ماکرولیدها………………………………………………………………………………27

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………30

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین………………………………………………………….31

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………32

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………..32

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین…………………………………………………33

1-19) فارماکوکینتیک………………………………………………………………………….34

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………….34

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………….35

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین…………………………………………………………..36

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین…………………………………..36

1-24) مراحل کلیدی فرایند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………….38

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………39

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن…………………..44

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding …………………………………….

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………….

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک……………………………………………………..48

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک……………………………………………………………….48

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………….49

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین…50

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………50

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی………………………………………………………………………51

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی…………………………………………………………………..55

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………57

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………..57

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده………………………………………………………………59

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد…………………………………………………..61

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها……………………………………………………………………..61

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها……………………………………………….61

1-24-4-2-2) تأثیر pH……………………………………………………………………………..

1-24-4-2-3) تأثیر دما……………………………………………………………………………..64

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی………………………………………………………………………..67

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………..68

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن……………………………………………………………..71

1-24-4-2-7) تأثیر کف…………………………………………………………………………….71

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………….73

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته…………………………………………………………………..74

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………..76

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول………………………………………………………77

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..79

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن…………………………………………………..79

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………….80

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا………………………………………………………………81

1-25-4) سویا در ایران……………………………………………………………………………82

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………..82

1-25-6) کنجاله سویا………………………………………………………………………………83

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..83

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………….84

1-26-2) تاریخچه کلزا……………………………………………………………………………..85

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………86

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا………………………………………………………………….86

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………88

فصل سوم : مواد و روش ها

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش…………………………………………………..93

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش…………………………………………………..93

 

 

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………….94

3-4) محیط های کشت مورد استفاده…………………………………………………………..95

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی………………………………………………………………….95

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………98

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………….99

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………….100

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………104

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر…….105

3-5) نمونه گیری…………………………………………………………………………………..106

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده………………………………………………………106

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ……………………………………………..

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 …………….

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4………………………………………………

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو…………………………………………………………….108

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………….109

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با بهره گرفتن از کلروفرم…………………….111

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………112

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………113

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………..113

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………113

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث…………………………………………………….114

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………..114

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………..114

3-7-5) تهیه مایع تلقیح…………………………………………………………………………115

3-7-6) تهیه چاهک………………………………………………………………………………116

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8……………………………………………………………..

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………..116

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………….117

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد………………………………………………..117

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………117

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………….118

3-8-1) فاز متحرک………………………………………………………………………………..118

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………118

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین…………………………………………………………119

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC ……………………………………………………………..

فصل چهارم: نتایج پژوهش

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین (محیط شاهد)…123

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………….123

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)……………………………….124

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………125

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…125

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین…………………128

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………129

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی……………………130

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی……….130

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین…………131

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر………32

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین………………………………….132

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر……………………………….133

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی………………………………..133

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea………

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…137

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………..137

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…..138

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین………………….144

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرایند……………………………145

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی……………………………………………………………………..146

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………148

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین………………………………….149

5-6) برآورد هزینه ها………………………………………………………………………………..153

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی….153 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر……………………154

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……..154

5-7) پیشنهادات………………………………………………………………………………………156

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………..158

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………….165

ضمائم ……………………………………………………………………………………………..166

چکیده:

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

1- کنجاله سویا 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا 15 گرم در لیتر ( هر کدام 50 % محیط )

2- کنجاله سویا 18 گرم در لیتر ( 60 % ) و کلزا 12 گرم در لیتر ( 40 % )

3- کنجاله سویا 12 گرم در لیتر ( 40 % ) و کلزا 18 گرم در لیتر ( 60 % )

4-کنجاله سویا 21 گرم در لیتر ( 70 % ) و کلزا 9 گرم در لیتر ( 30 % )

5- کنجاله سویا 9 گرم در لیتر ( 30 % ) و کلزا 21 گرم در لیتر ( 70 % )

 بر طبق نتایج بدست آمده، استفاده از مخلوط 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا ،دارای بالاترین میزان تولید اریترومایسین بوده و نسبت به استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا که حالت مورد استفاده در صنعت می باشد 011/1 برابر اریترومایسین بیشتری تولید نموده است.

مقدمه:

بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با بهره گرفتن از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( 48 ).

بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال 1880 برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(52).

در دهه 1940 و 1950 که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن حفظ شد. اما مدتی پس از کشف آنتی بیوتیک ها ، به دلایل متعدد، از جمله استفاده نادرست و یا بیش از حد از آنها ، مثلا استفاده تنها جهت فربه کردن دام ، سویه های میکرو ارگانیسم در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاوم شدند ، بطوریکه امروزه مجددا بیماری های عفونی ناشی از میکرو ارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب شده و هزینه های بسیار زیادی برای درمان آنها مصرف می شود.

طی سالهای 1925 تا 1965 استفاده از میکروبها در صنایع دارویی به صورت یک تحول اساسی زمینه را برای بکارگیری میکروارگانیسمها در تولید داروها و بویژه آنتی بیوتیکها فراهم ساخت و با گذشت زمان این روند تکامل یافت به طوری که امروزه بیو تکنولوژی در حال ورود به مرحله جدیدی است و به عنوان یک علم در عصر پیدایش و ساخت آنتی بیوتیکها توسعه چشم گیری داشته و در حال حاضر تولید انبوه فرآورده های میکروبی نظیر  آنتی بیو تیک ها  به صنعت چند میلیارد دلاری مبدل شده و از نقطه نظر اقتصادی ، آنتی بیوتیکها مهم ترین فراورده های صنعتی دنیای میکروبها محسوب می شوند(12).  بدین ترتیب بالا بردن راندمان تولید و اقتصادی تر کردن فرایند تولید آنتی بیوتیک ها جز اهداف ضروری است که با تلاش متخصصین در شاخه های مختلف علوم نظیر میکرو بیو لوژی ، بیو شیمی، مهندسی شیمی،بیوتکنولوژی و غیره می توان به آن دست یافت. در صنعت بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی نظیر آنتی بیوتیک ها دو بخش عمده وجود دارد :

1- عملیات بالا دستی(Up stream ) : که شامل دو بخش توسعه سویه و توسعه محیط کشت و تخمیر است و در این بخش ها نقش مهندسی شیمی و میکروبیولوژیست حائز اهمیت است. هدف از بخش توسعه سویه ، شناخت، تهیه و تثبیت میکروارگانیسم مولد محصول و هدف از بخش توسعه محیط کشت ، بهینه سازی محیط کشت از نظر میزان و نوع مواد، شرایط تولید و اقتصادی تر نمودن فرایند می باشد.

2- عملیات پایین دستی( D. stream) : در این بخش که در واقع فرآوری پس از تخمیر است، نقش مهندسان در جهت دهی فرایند تخمیر به سمت نتایج بسیار مهم می باشد. هدف از این مرحله، جداسازی و خالص سازی محصول می باشد. ( 17)

فصل اول: کلیات

1-1- طرح موضوع

در این پژوهش سعی بر این شده تا با بهره گرفتن از یک منبع نیتروژنی بومی ( ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا ) بتوانیم تولید صنعتی آنتی بیوتیک اریترومایسین را به روش فرمانتاسیون میکروبی بهینه سازی کنیم . امروزه در صنعت تولید این آنتی بیوتیک از کنجاله سویا استفاده می شود. اما در این پژوهش مشخص شد که استفاده از ترکیب این دو منبع نیتروژنی علاوه بر بالا بردن بازده محصول ، تولید اریترومایسین را از نظر اقتصادی مقرون به صرفه تر می کند. منبع نیتروژنی پیشنهاد شده با نسبت های مختلف به محیط کشت تخمیر باکتری Saccharopolyspora erythraea  اضافه شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری و میزان اریترومایسین تولیدی به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد.

2-1- بیان مسئله

امروزه بیماریهای عفونی ناشی از میکروارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب میشود و هزینه های زیادی برای درمان آنها اختصاص داده می شود. به همین علت نیاز به یافتن آنتی بیوتیکهای جدید و افزایش کارایی آنتی بیوتیکهای شناخته شده، بالا بردن بازده تولید و اقتصادی تر کردن فرایندهای تولید بسیار مهم می باشد. آنتی بیوتیکها مهمترین فراورده دنیای میکروبها هستند و جز پرمصرفترین داروها می باشند. کشف پنی سیلین توسط فلمینگ در سال 1929 را میتوان آغاز عصر آنتی بیوتیکها دانست. در تعریف کلی آنتی بیوتیک به ماده شیمیایی گفته میشود که توسط میکروارگانیسم تولید شده و میتواند بصورت انتخابی رشد سایر میکرو ارگانیسمها و یا تومورهای بدخیم را متوقف کند. امروزه این داروها در دامپزشکی هم کاربرد دارد و به عنوان ماده افزودنی در غذای حیوانات به کار می رود و همچنین به عنوان مواد حافظ گیاهان و غذاها نیز به کار میروند. بر اساس پیش بینی های انجام شده میزان مصرف این دارو در سال 2013 بیش از 40 میلیارد دلار میباشد و این میزان رو به افزایش خواهد بود. پس میتوان گفت که آنتی بیوتیکها اهمیت اقتصادی زیادی دارند. یکی از آنتی بیوتیکهای مهم و پرمصرف مورد استفاده اریترومایسین است که در درمان طیف وسیعی از بیماریها کاربرد دارد. این دارو جز ماکرولیدهاست و فرمول شیمیایی آنH H 67 NO13 و وزن ملکولی آن 94/733 گرم بر مول است.این آنتی بیوتیک با اتصال به زیر واحد 50 S ریبوزوم باکتریایی ممانعت کننده سنتز پروتئین هستند. لازم به ذکر است که پروتئینهای L15 و L16 در اتصال اریترومایسین به زیر واحد ریبوزوم نقش دارند. در پیکره اریترومایسین یک حلقه لاکتونی بزرگ وجود دارد که 13 کربنی است. همچنین یک قند آمین دار به نام دزز آمین دارد که با پیوند گلیکوزیدی به هسته لاکتونی متصل است. اریترومایسین یک ترکیب کریستالی بی رنگ است که در آب کم محلول است ولی در بسیاری از حلالهای آلی مانند استن به خوبی قابل حل است. اریترومایسین یک باز ضعیف است و طعم تلخی دارد. این دارو باکتریو استاتیک است ولی در غلظتهای بالا باکتریوساید میشود. این دارو برای درمان برنشیت، زخمهای عفونی،دیفتری، گلودرد،تب مخملک و … موثر است. بازار مصرف این دارو اکنون دارای رشد 6 تا 8 درصد افزایش تولید در سال میباشد. آمار مصرف آن در ایران در سال 89 ، 2/11 میلیارد تومان گزارش شده است.

اریترومایسین علیه ارگانیسمهای گرم مثبت نظیر استرپتوکوک، استافیلوکوک، پنوموکوک و ارگانیسمهای گرم منفی مثل نایسریا و بردتلا پرتوسیس موثر است.این دارو جایگزین مناسبی برای پنی سیلین در افراد آلرژیک نسبت به پنی سیلین است.  با توجه به این نکته تلاش برای بهینه سازی و کاهش قیمت روند تولید این دارو با اهمیت است و در این پژوهش سعی بر این شده که راه حلی برای کاهش قیمت و بومی سازی تولید این دارو پیدا شود. به طور کلی فرایند تولید آنتی بیوتیکها شامل 5 مرحله اصلی است .آنچه در این پژوهش بیشتر مدنظر است ، تغییر در ترکیبات محیط کشت به کار رفته در مرحله تخمیر است. عمل تخمیر در فرمانتور یا بیوراکتور انجام میشود. یک فرایند تخمیری به روش های غیر مداوم، مداوم و نیمه بسته انجام میشود.عواملی در طی یک فرایند تخمیر بیشترین اهمیت را دارند و محققان با تغییر در شرایط آنها سعی در بالا بردن بازده و کاهش هزینه های تولید دارند. این عوامل عبارتند از : ترکیبات محیط کشت، درجه حرارت، هوادهی، pH ، همزنی، دی اکسید کربن، کف، استرلیزه بودن محیط و ظروف.

در تهیه محیط کشت، تاکید زیادی روی کنترل کردن بهای مواد خام میشود. زیرا این مواد میتوانند تاثیر مهمی روی محصول نهایی بگذارند. از جمله معیارهای دیگر برای انتخاب مواد خام :

– حداکثر بازدهی محصول به ازای هر گرم سوبسترا فراهم کند.

– حداکثر غلظت محصول را فراهم کند و اجازه حداکثر سرعت تولید را بدهد.

– ارزان باشد و در طول سال با کیفیت یکسان و به راحتی در دسترس باشد.

– حداقل مشکلات را در جنبه های دیگر فرایند مخصوصا هوادهی و هم زدن و خالص سازی و استخراج و…. فراهم کند.

از جمله منابع گوناگونی که در محیط کشت تخمیر مورد استفاده قرار می گیرند منابع کربنی مثل عصاره مالت، نشاسته، دکسترین، روغن سویا  و منابع نیتروژنی هستند. نیتروژن غیر آلی بصورت سولفات آمونیوم به کار می رود. منابع نیتروژن آلی مثل اوره و پروتئین ها می باشد. بهینه سازی ترکیبات محیط کشت یکی از روش های کارامد و عوامل موثر برای افزایش تولید فراورده های بیوتکنولوژیک می باشد و در این راه منابع نیتروژنی سهم زیادی دارند. کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان دو منبع نیتروژنی اصلی دارای یکسری ویژگی هایی هستند که باعث گردیده استفاده از آنها در صنعت تولید آنتی بیوتیک مقرون به صرفه باشد و موجب خودکفایی کشور در این زمینه میشوند. برخی از این ویژگی ها عبارتند از:

فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه……………………………………………………………………. 1

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته………………………………………………. 1

1-1 سلول­های بنیادی جنینی……………………………………………………… 3

1-2 سلول­های بنیادی بالغ…………………………………………………………. 4

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان………………………………………………. 5

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی………………… 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی…………… 8

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی…………………………. 10

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی………………………………. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها…17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک…………………………………………………….. 17

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک…………………………………………… 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی…………………………. 20

1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین…………………………. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین……………………………….. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی……………………………………………………. 25

1-6-1 نوروسفر…………………………………………………………………….. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی………………………………….. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق………………………………………………………… 33

فصل دوم: مواد و روش­ها…………………………………………………………… 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی……………………………………….. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ…36

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM…………………………………………….

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH)………………………. 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA…………………………………………………

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان……………… 39

2-2-5 پاساژ سلولی……………………………………………………………… 39

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی………. 39

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71………………………………………………..

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%…………………………………………….. 41

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد…………………………………………….. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%…………………………………………………… 41

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH)……………….. 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول………………………………………………….. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز………………………………………………. 43

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی….44

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی…………… 45

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین……………….. 46

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده …………………………..46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده…………………………….. 48

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز …………………………………………………………49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-)……………… 52

2-6-5 انتخاب پرایمر……………………………………………………………… 53

 

 

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها……………………………………………………… 54

2-6-7 واكنش PCR……………………………………………………………….

2-7 آنالیز آماری………………………………………………………………….. 58

فصل سوم: نتایج…………………………………………………………………. 59

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت….59

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز….60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت….60

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی….60

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین……………….. 61

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیک و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن…61

4-1 نتیجه ­گیری و بحث………………………………………………………… 70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها…71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی…72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی……74

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت….76

4-5 نتیجه گیری…………………………………………………………………… 77

پیشنهادات…………………………………………………………………………. 77

مراجع ………………………………………………………………………………..79

چکیده:

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­ کنند استفاده شد.

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)  

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­ کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­ شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

مقدمه:

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­ شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­ شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­ شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­ کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه ­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­ کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیک نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یک منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

1-1- سلول­های بنیادی جنینی

اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[

این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[

 این سلول­ها از توده سلولی داخلی بلاستوسیست جداسازی می­شوند که دارای توانایی تمایز و    تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند، این ویژگی را Pluripotent  می­نامند. محققین اولین بار این سلول­ها را از mice  و اخیرا” از انسان و پریمات­ها جداسازی کرده ­اند] 22، 23[. یک نکته مورد توجه در ارتباط با سلول­های بنیادی جنینی موش این است که این سلول­ها پس از آنکه در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی قرار می­گیرند، تکثیر شده و بعد از پیوند به جنین­ در مرحله قبل از کاشته شدن، ویژگی پلوری­پوتنتی خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافت­های تمایز نیافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را تولید کنند ]7، 24[ مشابه همین ویژگی­ها در سلول­های بنیادی جنینی انسان نیز دیده شده است ]7[. بنابراین گرچه سلول­های بنیادی جنینی از قدرت تكثیر و تمایز بالایی برخوردارند اما كاربرد این سلول­ها با موانع اخلاقی و قانونی همراه بوده و پاسخ ایمنی را در فرد گیرنده افزایش می‌دهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتی سلو­ل­های بنیادی جنینی انسان یا موش به حیوانات  متولد شده پیوند زده می­ شودند تولید تومور می­ کنند که حاوی انواع متفاوتی از بافت­ها شامل: پوست، مو و عضله می­باشد که تراتوما نامیده می­ شود ]25[، حضور سلول­هایی از سه لایه جنینی در این تومور، نشان دهنده ظرفیت تمایزی بالای این سلول­هاست بنابراین استفاده درمانی از این سلول­ها با مشکلاتی همراه است]7[.

2-1- سلول­های بنیادی بالغ

سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بافتی که از آن منشا می­گیرند، تمایز یابند. این سلول­ها را می‌توان در بافت­هایی مثل استخوان تیغه‌ای (ترابكولار)، بافت چربی، مغز، سینوویوم، عضله اسكلتی، ریه، طحال، كبد، كلیه، مغز استخوان، غضروف، قلب، پوست، دندان­های شیری و سلول­های اطراف عروق مربوط به ژله‌ وارتون بند ناف انسان نیز مشاهده نمود [14،26]. یکی از نکات مهم در مورد سلول­های بنیادی بالغ این است که تعداد آن­ها در هر بافتی محدود است. این سلول­ها در حالت عادی در ناحیه خاصی از هر بافت به صورت خاموش به حالت تقسیم نشده وجود دارند و قادرند تحت شرایط فیزیولوژیک یا بدنبال ایجاد ضایعه، به سلول­های بافتی كه در آن قرار دارند تمایز یابند و بافت آسیب دیده را ترمیم كنند و یا تحت شرایط خاصی نیز به به سلول­های دیگری كه مربوط به آن بافت خاص نمی‌باشد تمایز می‌‌یابند، به این ویژگی Trans-differentiation و یا Adult­ stem cell plasticity می‌گویند [3،27،28].

Ferrari و همکارانش در سال 1998 اولین بار differentiatio Trans- سلول­های BMSCs  را به سلول­های عضلانی و در همان سال Shi و همکارانش تولید سلول­های اندوتلیال از BMSCs را گزارش دادند]29،30[.Petersen  تولید سلول­های کبدی از مغز استخوان را بعد از آسیب کبدی و Brazelton و همکارانش در سال 2000  تولید نورون از  BMSCs را گزارش دادند ]31،32 .[در سلول­های استخراج شده از بافت­های دیگر مانند عضله اسکلتی ]33 [و مغز ]34 [نیز این قابلیت تمایزی مشاهده شده است. امروزه فناوری سلول­های بنیادی و قابلیت تمایز آن­ها به انواع سلول­های بالغ و همچنین استفاده از آن­ها در درمان بیماری­ها به طور روز افزونی در حال پیشرفت بوده که امیدواری­هایی را در جهت ایجاد روش­های مبتنی بر سلول درمانی به عنوان یک جایگزین مناسب برای پیوند اندام کامل ایجاد نموده است.

1 progenitor

2  Niche

3 symmetric

4 asymmetric

1 Totipotent

فهرست مطالب:

خلاصه فارسی…………………………………………………………………………………. 1

مقدمه ………………………………………………………………………………………….. 3

فصل اول: کلیات

1-1 تعریف بیماری لیشمانیوز………………………………………………………………… 6

1-1-2 تاریخچه لیشمانیوز در جهان………………………………………………………….. 7

1-1-3 تاریخچه لیشمانیوز در ایران……………………………………………………………. 8

1-2 رده­بندی و طبقه ­بندی انگل لیشمانیا…………………………………………………… 9

1-3 مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا……………………………………………… 11

1-3-1-1 مورفولوژی انگل……………………………………………………………………… 11

1-3-1-2 شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)…………………………………. 11

1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستیگوت)…………………………………………………….. 12

1-3-2-1 سیر تکاملی انگل……………………………………………………………………. 15

1-3-2-2 سیر تكاملی انگل در بدن حشره…………………………………………………… 15

1-3-2-3 پشه خاكی……………………………………………………………………………. 15

1-3-2-4 سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار…………………………………………. 16

1-4  راه های انتقال لیشمانیا به انسان……………………………………………………….. 18

1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی………………………………………………………. 19

1-4-2  انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19

1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19

1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19

1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………………………………………………………… 25

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28

1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD+4……………………………………………………..

1-7  روش های تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30

1-7-1 روش های مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31

1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32

1-7-2  روش های ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35

1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

فصل سوم: مواد و روشها

3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌…………………………………………………

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..

3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45

3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46

 

 

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…. 52

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………….. 53

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..

3-5-4 آماده ­سازی نمونه………………………………………………………………………….. 57

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..

3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………… 67

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………..

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….

فصل چهارم: نتایج

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution………………………

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها…………………………………………… 72

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford………………………………..

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………………………………….

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C…………………………………………….

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………….

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی………………………………. 79

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

منابع……………………………………………………………………………………………… 95

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106

خلاصه فارسی:

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­ کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­ شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با بهره گرفتن از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با بهره گرفتن از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­ کلون­ های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

یافته ­ها: اطلاعات نشان دادند که تک­ کلون­های جداشده توانایی القاء واکنش­های درون­تنی و برون­تنی قابل مقایسه­ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی­ژن خالص و هموژن را در تست­های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند

مقدمه:

انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)دار از جمله انسان منتقل می­ شود(99).

به بیماری­های حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته می­ شود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی می­باشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL)[1]، جلدی مخاطی (ML)[2] و احشایی (VL)[3] بروز می­ کند(57،83).

عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در  بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماری­ها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).

سازمان بهداشت جهانی آن را  در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز می­باشد(49).

افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راه­های مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.

فصل اول: کلیات

تعریف بیماری لیشمانیوز:

انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا  یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگل­ها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)دار از جمله انسان منتقل می­ شود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).

این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).

یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزوم­های ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم می­گردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).

میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)دار وخزنده است که میزبان PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)دار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
می­باشد(20،92،69،101).

عامل بیماری­زایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN[1] دیده می­ شود (3).

2-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در جهان

کانینگهام[1] در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان[2] در طحال سربازی که از تب دام دام[3] در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.

در همین سال دونووان[4]  در مدرسه هندوستان اجسامی شبیه به آن چه لیشمان در بیماری دام دام یافته بود در طحال بیمارانی که مبتلا به تب های نامرتب می­شدند مشاهده کرد. امروزه به تب دام و سایر بیماری های شبیه به آن لیشمانیوز احشایی یا کالاآزار گفته می­ شود. راس  نیز در سال 1903 جنس لیشمانیا را معرفی کرد. لاوران ومسنیل در همان سال نام لیشمانیا دونووانی را به عنوان عامل بیماری کالا آزارپیشنهاد کردند. سپس تشابه شکل انگل زخم شرقی وعامل کالاآزار تایید گردید و لوهه در سال 1906 نام لیشمانیا تروپیکا را برای عامل زخم شرقی و یا سالک پیشنهاد کرد(53،95).  ونیون در سال 1911 خاطر نشان ساخت که فلبوتوم ممکن است ناقل بیماری های ناشی از لیشمانیا باشد. ولی 30 سال گذشت تا نظریه ونیون توسط آدلر  به اثبات رسید. این محققین نشان دادند که فلبوتوموس پاپاتاسی در حقیقت ناقل لیشمانیا تروپیکا به انسان است وسوامینات  و همکاران ملاحظه کردند که فلبوتوموس آرجنتیپس  ناقل لیشمانیا دونووانی است(86،87،93).

3-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در ایران

در کتاب قانون ابوعلی سینا در مورد زخمی به نام جیرونیه یا خیرونیه که درمان مشکلی دارد و در برابر داروهای گوناگون مقاومت می کند بحث شده است. در شرح اسباب ملانفیس از بیماری ای به نام شلیم نام برده شده که تظاهرات آن با زخم سالک مشابه است (3).

در اوایل قرن بیستم مطالعات کاملی درباره لیشمانیوز پوستی در تهران توسط دکتر پولاک که یکی از اساتید پزشکی مدرسه دارالفنون بود، انجام گرفت. وی شرح جامعی درباره بیماری سالک نوشت.

در سال 1916 گاشه از دیگر اساتید پزشکی دارالفنون 21 سگ را در تهران مورد مطالعه قرار داد که 15 سگ به سالک مبتلا بودند.

از  سال 1320 به بعد محققان ایرانی نظیر دکتر انصاری، دکتر مفید و دکتر ندیم در مورد اپیدمیولوژی، خصوصیات آزمایشگاهی انگل، گونه های پشه خاکی مناطق آلوده و درمان انواع سالک در نقاط مختلف ایران مطالعات و آزمایشاتی را انجام دادند(9). در 1328 برای نخستین بار دکتر پویا در مقاله ای سه مورد بیماری را که از لحاظ بالینی و آزمایشگاهی تشخیص آنها قطعی بود معرفی کرد و وجود کالاآزار در ایران را اعلام نمود.

از سال 1328 تا 1340تعداد 24 مورد کالاآزار از نقاط مختلف کشور نظیر تهران، تنکابن، آبادان، شیراز و نیشابور گزارش شد. از 1340 به بعد موارد بیشتری از بیماری بخصوص در استان فارس و بین عشایر بصورت تک گیر مشاهده شد. در فاصله سالهای 1353 تا 1358 فقط در بیمارستانهای وابسته به دانشگاه شیراز 131 مورد کالاآزار گزارش شد که اکثر بیماران اطفال زیر 7 سال بودند(2.3).

مطالعاتی که در سالهای 1364 تا 1368 در مشکین شهر استان اردبیل انجام گرفت نشان داد که بیماری در این مناطق از سالها قبل به صورت اندمیک (بومی) وجود داشته است و ممکن است در سالهای اخیر به صورت اپیدمی بروز کرده است. زیرا در این مدت بیش از 600 مورد کالاآزار از استان اردبیل تشخیص داده شد که 520 مورد آن در شهرستان مشکین شهر بوده است(2،6).

[1]-  Cuningham

[2] -leishman

[3] -Dum Dum fever

فهرست مطالب:

1- مقدمه………………………………………………………………. 2

1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک…………………………………………… 2

1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها……………………………… 5

1-1-2- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک…………………………………….. 7

1-1-3- عوامل موثر بر تولید آنتی بیوتیک……………………………. 7

1-1-4- ویژگی‌های یک آنتی‌بیوتیک…………………………………. 8

1-2-نیاز به کشف ترکیبات فعال زیستی……………………………. 8

1-2-1- کشف ترکیبات فعال زیستی………………………………… 9

1-2-2- محدودیت های کشف ترکیبات فعال از طبیعت…………….. 9

1-3- روش‌های نوین کشف دارو……………………………………… 10

1-3-1- منابع برای داروهای جدید…………………………………… 10

1-3-2-  روند کنونی کشف دارو……………………………………… 10

1-3-3- مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیاز به داروهای جدید…………11

1-3-4-  استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………..14

1-4-  علت انتخاب میکروارگانیسم‌ها برای کشف ترکیبات فعال زیستی…..14

1-5- اکتینومیست‌ها………………………………………………… 14

1-5-1-  ویژگی‌ اکتینومیست‌ها……………………………………. 15

1-5-2-  مورفولوژی اکتینومیست‌ها……………………………….. 16

1-5-3-  فیزیولوژی اکتینومیست‌ها………………………………… 17

1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها…………………………………… 18

1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها ………………………………19

1-5-6- متابولیت‌های ثانویه……………………………………….. 20

1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال…………… 21

1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست…..23

1-5-8-  اهمیت استرپتومیسس‌ها………………………………. 24

1-5-9-  اکتینومیست‌های دریایی……………………………….. 25

1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی….27

1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید……28

1-6- اهداف پژوهش………………………………………………….29

2- مواد و روش‌ها……………………………………………………. 32

2-1- دستگاه‌ها و تجهیزات………………………………………….32

2-2- محلول‎ها و مواد مورد نیاز ……………………………………33

2-3- جمع‌ آوری نمونه………………………………………………. 36

2-4- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها………………………..37

2-5- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها…………….38

2-6- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی……………………..38

2-6-1- نگهداری کوتاه‌مدت………………………………………… 38

2-6-2- روش نگهداری بلند مدت…………………………………… 38

2-7- شناسایی باکتری‌ها ………………………………………….39

2-7-1- بررسی مورفولوژی………………………………………….39

2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم…………..39

2-7-3-تولید پیگمان محلول………………………………………….40

2-8-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی….40

2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست……….41

2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی…..41

2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال…………..41

2-10-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال……………. 42

2-10-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک…..43

2-10-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین….43

2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال ……………….44

2-13- استخراج  نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر ………………..44

2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد……………………………..45

2-15- تکثیر ژن rDNA 16S …………………………………………

2-15-1- برنامه PCR برای ژن‌های 16S rDNA:……………………

2-16- تخلیص محصول PCR………………………………………..

2-17- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA…………………………..

2-17-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:……………………………..

2-17-2- انجام BLAST………………………………………………

 

 

2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA……………………

3- نتایج………………………………………………………………. 50

3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها……………………………………. 50

3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال…………….. 52

3-3- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا….55

3-4- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال…………………..56

3-5- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک….58

3-6- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)….59

3-7- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها……………………………………….. 61

3-8- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها……………… 61

3-9-تولید پیگمان محلول……………………………………………….65

3-10- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز……………..66

3-11- تکثیر ژن 16s rDNA جدایه‌های فعال…………………………..67

3-11-1- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA

4- بحث و پیشنهادات………………………………………………….. 73

4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی………………………….. 75

4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال……………………….. 75

4-3- استخراج متابولیت‌ها…………………………………………….. 76

4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال…………………….. 76

4-5- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین…77

4-6- مورفولوژی کلنی‌ها………………………………………………. 78

4-7- بررسی توالی‌ 16S rDNA………………………………………..

4-8- جمع بندی ………………………………………………………… 79

4-9-پیشنهادات …………………………………………………………..81

چکیده:

اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق 5 و 10 متر جمع‌ آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با بهره گرفتن از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه 7 جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±1.4) و (18±1.4) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (14±1.4) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن 16S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ ها نشان داد که 7 جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با  خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد.

فصل اول: مقدمه

1- مقدمه

1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک

مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت.

 آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور و رابرت کخ باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند.

اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام كارهای معمول آزمایشگاهی كه می‌بایست كشت‌های باكتریایی را كه در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد كرده بودند زیر میكروسكوپ بررسی كند، متوجه شد كه در یكی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد كه ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود كه وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تكه‌ای كپك به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت كه كپك چیزی تولید می‌كند كه باعث مرگ باكتری‌های استافیلوكوكوس در ظرف كشت شده بود. فلمینگ كپك را جدا كرد و آن را به عنوان یكی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم شناخت، و ماده آنتی بیوتیكی را كه تولید می‌كرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد كه پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلكه عاملی شد تا برای كشف آنتی بیوتیك‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از تركیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد.

 در سال 1945 جایزه نوبل در پزشكی به طور مشترك به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004).  استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها  که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003).

1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها

بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند.

1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باكتری‌ها یک لایه خارجی سخت دارند كه دیواره سلولی آنها است و شكل میكروارگانیسم را تعیین می‌كند و از سلول باكتری كه فشار اسموتیک بالایی دارد محافظت می کند . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌ انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها.

2-1-1-1- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین).

3-1-1-1- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA  می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند.

4-1-1-1- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یک غشای سیتوپلاسمی محصور شده كه به‌عنوان یک غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌كند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مكانیسم اثر پلی‌میكسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باكتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی كه با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، كلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول، ایمیدازول، تری آزول‌ها و یونوفورها اشاره كرد.

2-1-1- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک

ژن تولیدکننده آنتی‌بیوتیک و دیگر متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌ها معمولا به‌صورت کلاستر و یا به صورت پلاسمیدهای خطی بزرگ دیده می‌شوند. از نظر ژنتیکی آنتی بیوتیک‌ها با وزن مولکولی پائین، ساختار بسیار پیچیده دارند که نزدیک به 50 ژن در سنتز آنها دخالت دارد (Cundliffe, 2006). این در حالی است که یک ژن به آسانی می‌تواند یک پروتئین به وزن 100 کیلو دالتون را رمز گذاری کند(Challis, 2003). بعضی از جنس‌های استرپتومیسس بیش از 20 کلاستر ژنی را به سنتز متابولیت‌های ثانویه اختصاص داده‌اند. هر آنتی بیوتیک حدود 1% از کل ژنوم اکتینومیست تولید کننده را لازم دارد. علاوه بر ژن‌های لازم برای سنتز آنتی بیوتیک بعضی کلاستر‌ها دارای ژن‌های تنظیم کننده تولید آنتی بیوتیک می‌باشند (Cundliffe, 1989).

[1] . Clustered

[1] . Cidal

[2] . Static

[1] . Santonin

[2] . Cinchona  

[3] . Paul Ehrlich

[4] . Arsphenamine

[5] . Antibiosis

[6] . Vilmain

[7] . Antagonism

[8] . Louis Pasteur

[9] . Robert Koch

[10] . Allexander Fllemiing

[11] . Staphylococcus

[12] . Penicillium

[13] . Florey

[14] . Chain

[15] . Penicllium notatum

فهرست مطالب:

چکیده………………………………………………………………………. 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه………………………………………………………………… 3

1-2- بیان مسئله…………………………………………………………. 4

1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق……………………………………. 5

1-4- ادبیات تحقیق………………………………………………………. 6

1-5- اهداف تحقیق……………………………………………………… 10

1-5-1 اهدف کلی……………………………………………………….. 10

1-5-2 اهداف جزئی…………………………………………………….. 10

1-5-3 اهداف کاربردی………………………………………………….. 11

1-6- سؤالات تحقیق…………………………………………………… 11

فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- خلیج فارس……………………………………………………….. 13

2-2- استان بوشهر…………………………………………………….. 14

2-3- نفت و آلودگی‌های نفتی………………………………………… 15

2-4- ورود نفت به آب دریا………………………………………………. 17

2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا…………………………….. 17

2-5-1 پراکنده شدن…………………………………………………….. 18

2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب………………………….. 18

2-5-3 حل شدن………………………………………………………… 18

2-5-4 تبخیر شدن……………………………………………………… 18

2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی……………………………………. 18

2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن…………………………………….. 19

2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی………………………………………….. 19

2-5-8 ته نشین شدن………………………………………………… 19

2-6- تجزیه‌زیستی………………………………………………………20

2-7- معرفی هیدروکربن‌های آروماتیک………………………………. 20

2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک…………………………………. 20

2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک……………………………….. 21

2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی…………………………………… 22

2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک……………………………… 23

2-7-5 اثرات هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده….27

2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان……….. 27

2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا می‌کند؟……………………. 27

2-8- فنل……………………………………………………………….. 28

2-8-1 کلیات ترکیب فنل………………………………………………. 28

2-8-2 نام‌گذاری……………………………………………………….. 28

2-8-3 فنول‌های طبیعی……………………………………………… 29

2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی………………………. 29

2-8-5 خواص فیزیکی………………………………………………… 29

2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده…………………..30

2-8-7 کاربردها………………………………………………………… 30

2-9- تجزیه‌زیستی……………………………………………………. 30

2-9-1 روش‌های پاکسازی بیولوژیکی…………………………….. 31

2-9-2 مبانی زیست‌درمانی…………………………………………. 32

2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی…………………………………… 32

2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی………………………………. 32

2-9-5 مخمرها و قارچ‌ها……………………………………………… 33

2-9-6 استفاده از بیوراکتور‌ها……………………………………….. 33

2-9-7 کو‌متابولیسم………………………………………………….. 34

2-9-8 دی‌نیتریفیکاسیون……………………………………………..34

2-9-9 کمپوست کردن……………………………………………….. 34

2-9-10 درمان بیولوژیکی……………………………………………. 34

2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک……….35

2-11- مسیر های تجزیه زیستی………………………………….. 36

2-11-1 تجزیه میکروبی فنل…………………………………………. 36

2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین…………………………………….. 39

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

 

 

3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده……………………………… 44

3-1-1 محیط ONR7a………………………………………………….

3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار………………………………. 45

3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار……………………………………. 45

3-1-4 محیط مارین براث (MB)……………………………………….. 45

3-1-5 محیط مارین آگار (MA)………………………………………… 46

3-1-6 محیط نوترینت براث (NB)……………………………………… 46

3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA)……………………………………… 46

3-2- محلول‌ها………………………………………………………… 47

3-2-1 سرم فیزیولوژی……………………………………………….. 47

3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA)…………….. 47

3-2-3 محلول Tris-Base……………………………………………..

3-2-4 محلول TBE……………………………………………………

3-2-5 محلول   EDTA Tris-Base- (TE)……………………………

3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید……………………………………….. 48

3-3- مواد مصرف شده در PCR……………………………………..

3-4- دستگاه‌های مورد استفاده……………………………………. 49

3-5- روش عملی…………………………………………………….. 50

3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده…50

3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط…………………….. 51

3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف………………………….. 51

3-5-2-2 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده نفتالین……………….. 51

3-5-2-3 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل……………………. 51

3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده………………………… 51

3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده………..51

3-5-3-2 تست های تکمیلی………………………………………. 52

3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری………………………………….. 52

3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24)……………………… 52

3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل…………………………………….. 52

3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین………………………………….. 52

3-5-4 شناسایی باکتری ها………………………………………… 53

3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم……………. 53

3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده……………………….. 54

3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR……………….

3-5-4-4 بررسی محصول PCR……………………………………….

3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها…..55

 فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

4-1- نمونه برداری………………………………………………….. 57

4-2- شمارش باکتری ها…………………………………………… 58

4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها……………………………. 58

4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها…………………………. 60

4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین……………… 61

4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده……………… 62

4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل…..62

4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده نفتالین…..62

4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین…..63

4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین…63

4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24)……………………… 67

4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک……………………….. 71

4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین………………………………… 71

4-5-3-2 سنجش حذف فنل……………………………………… 73

4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک….75

4-6-1 بررسی محصول PCR………………………………………

4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها……………….. 76

4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها………………………… 92

4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها………………………………… 94

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث و نتیجه گیری…………………………………………… 97

5-2- پیشنهادات……………………………………………………. 100

منابع و مآخذ………………………………………………………… 101

فهرست منابع فارسی…………………………………………….. 101

فهرست منابع انگلیسی………………………………………….. 103

چکیده انگلیسی……………………………………………………. 108

چکیده:

ترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آن‌ ها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال 2013 بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌ های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روش‌های کاهش آلاینده‌های مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسم ها جهت پاکسازی این‌گونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتری‌های جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتری‌های جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمر‌های Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد 9 باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این تحقیق به وجود آلودگی به فنل و نفتالین در نوار ساحلی استان بوشهر و تفکیک منطقه‌ای هر باکتری انجامید. سپس با توجه به رسم درخت فیلوژنی و بررسی فاصله بین نمونه‌ها از صحت نتایج اطمینان حاصل شد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه

خلیج‌فارس به دلیل شرایط اقلیمی ویژه‌ی حاکم بر آن بسیار شکننده و آسیب‌پذیر است و ورود کمترین آلاینده‌ها به داخل دریا اثرات مخربی بر سلامت آبزیان و موجودات آن دارد. خلیج‌فارس با تمام مشکلات محیطی و اقلیمی که بر آن حاکم است از تنوع ژنی بالایی برخوردار است. از طرفی خلیج‌فارس محل حمل و نقل جهانی محسوب می‌شود و این امر موجب شده در سال‌های گذشته لکه‌های نفتی بسیاری از این نفت‌کش‌ها در آب‌های خلیج‌فارس به جا بماند, از طرفی آلاینده‌های صنایع حاشیه سواحل وارد آب این دریا         می‌شوند و همچنین بخشی از آلاینده‌ها بر اثر حرکت نفت‌کش‌ها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتی‌ها- حفاری و عملیات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ریختن زباله‌ها از داخل شناور‌ها به خلیج‌فارس تزریق می‌شوند. مرجان‌های زیبا و گونه‌های نادر گیاهی و جانوری در حالی قربانی توسعه بی رویه غیر اصولی و هجوم انواع آلاینده‌ها به درون دریا می‌شوند که هنوز سازمان حفاظت از محیط زیست به عنوان دستگاه متولی حفظ محیط زیست نتوانسته اقدام موثر و شایسته‌ای در این زمینه انجام دهد. که در نهایت اینگونه بی‌توجهی‌ها منجر به مرگ و میر آبزیان و مهاجرت آن‌ ها به خارج از منطقه, تغییرات در تنوع زیستی و کاهش تنوع زیستی و تغییر رفتار موجودات در محیط زیست منطقه می‌شود که از جمله آثار ناشی از آن آلودگی دریاهاست.

بخش اعظم آلاینده‌های موجود در خلیج‌فارس از نوع نفتی است, از طرفی نفت از میلیون‌ها ترکیب تشکیل شده است که در کل می‌توان آن‌ ها را در 4 دسته تقسیم‌بندی کرد که عبارتند از ترکیبات آروماتیک, هیدروکربن‌های اشباع, رزین‌ها و آسفالتن‌ها. از طرفی ترکیبات آروماتیک با توجه به تعداد حلقه‌های بنزنی به کار رفته در ساختارشان تقسیم‌بندی می‌شوند که در این پروژه از فنل بعنوان یک ترکیب آروماتیک تک حلقه و از نفتالین بعنوان یک ترکیب دو حلقه استفاده شده است. ترکیبات آروماتیک از طریق استنشاق, بلعیدن و تماس مستقیم با پوست قابلیت ورود به بدن داشته و در صورت بروز این رخداد منجر به بروز علایمی چون استفراغ, سرگیجه و اسهال می‌شود و با توجه به خصوصیات شیمیایی که دارا می‌باشند, توانایی ایجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و می‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در این پروژه با بررسی آلودگی منطقه ساحلی استان بوشهر به ترکیبات آروماتیک موفق به جداسازی و شناسایی 9 سویه تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک شده و با رسم درخت فیلوژنی به بررسی جد مشترک میکروارگانیسم‌ها پرداخته‌ایم. بطور کلی این پایان ‌نامه از 5 فصل تشکیل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کلیه قسمت‌های مربوط به پروپوزال جهت بیان مسئله و ارائه ضروریات اجرایی شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق. فصل سوم شامل روش اجرای تحقیق می‌باشد.در فصل چهارم به تجزیه و تحلیل داده‌ها پرداخته ودر نهایت در فصل پایانی به بحث و نتیجه‌گیری و بیان پیشنهادات می‌پردازیم.

2-1- بیان مسئله

تجزیه زیستی مواد، به فرایندی اطلاق می‌شود که در طی آن مواد آلوده‌کننده خارجی به وسیله میکروارگانیسم‌هایی که قادرند از آنها استفاده کنند، به مواد بی‌ضرر تبدیل می‌شوند (Luis and Mara et al 2000, 69-75; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496). که در آن از میکروب‌های مختلف استفاده می‌شود و اساس کار آن استفاده از جمعیت‌های میکروبی به منظور تجزیه آلاینده‌ها بوده بنابراین ضرورت نظافت زیستگاه‌های طبیعی جمعیت‌های میکروبی قبل از هر کار دیگر لازم و ضروری می‌باشد (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752). آلودگی نفتی از معضلات زیست محیطی می‌باشد، هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46) نفت‌خام کمپلکس پیچیده‌ای از مخلوط صد‌ها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربن‌ها, نیتروژن, گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربن شامل ترکیبات آروماتیک, آلیفاتیک و آسفالتی است (Sisler and Zobell 1987, 521-522; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496; Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) ورود هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای PAHs[1] به محیط زیست, اثرات بسیار خطرناکی در زندگی انسان خواهد داشت. مشخص شده است که PAH ها عوامل بالقوه سرطان‌زا برای انسان می‌باشند و به سرعت وارد بدن شده و در بافت‌های چربی بدن ذخیره می‌شوند (Koch and Fuchs 1992, 649-671). هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46). این آلاینده‌ها یکی از مهمترین آلودگی‌های زیست محیطی دنیا محسوب می‌شود که در اثر دفع و دور ریز نامناسب فاضلاب‌ها، ضایعات، پساب صنعتی و پخش آلاینده‌ها توسط نیروگاه‌ها و نشت آلاینده‌ها از مخازن نفت و ایستگاه سوختگیری و غیره وارد محیط زیست می‌شوند ((Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46; Cappello and Crisari et al. 2012, 39-50). استفاده از فعالیت‌های بیولوژیکی محیطی (باکتری‌های تجزیه کننده) در جهت حذف هیدرو‌کربن‌های نفتی که در این تحقیق ترکیبات آروماتیک می‌باشد نسبت به روش‌های فیزیکی (سوزاندن) که آلودگی زیست محیطی ایجاد می‌کند و روش شیمیایی (سورفکتانت‌ها) که روشی پر‌هزینه و دارای محدودیت می‌باشد مزیتی قابل توجه‌ای دارد (MacGillirray and Shiaris et al 1999, 90-101; Vinas and Grifoll et al 2002, 252-261; Moslemi and Vosoughi et al 2005, 15-23). میزان تجزیه و معدنی شدن ترکیبات آلی وابسته به غلظت ترکیبات است بطوریکه غلظت بالای هیدروکربن‌ها با محدود کردن مواد غذایی و اکسیژن یا از طریق اثرات

فهرست مطالب:

فصل اول:مقدمه

1-1- تالاب ها………………………………………………………………………………………2

1-2- تعریف تالاب………………………………………………………………………………….2

1-2-1- تعریف تالاب از نظر کنوانسیون رامسر …………………………………………………3

1-3- طبقه بندی تالاب…………………………………………………………………………….4

1-3-1- تقسیم بندی تالابهای ایران……………………………………………………………..6

1-4- کنوانسیون رامسر……………………………………………………………………………9

1-4-1- طبقه بندی تالابها توسط کنوانسیون رامسر………………………………………….9

1-5- عملکرد و ارزش تالاب……………………………………………………………………….10

1-5-1- زیستگاهی برای حیات وحش و آبزیان …………………………………………………10

1-5-2- مکانی برای تحقیقات علمی و آموزشی …………………………………………..11

1-5-3- چرخه وتغییر شکل (دگرگونی) مواد…………………………………………………….11

1-5-4-تغییر و کاهش قدرت تخریب سیلاب……………………………………………………11

1-5-5-تغذیه آب های زیر زمینی…………………………………………………………………12

1-5-6- حفظ و نگهداری ذرات معلق ……………………………………………………………12

1-5-7- صادرات محصولات……………………………………………………………………….12

1-5-8- مواد خام  ………………………………………………………………………………..12

1-5-9- تفرج ………………………………………………………………………………………13

1-5-10-تثبیت خاک ……………………………………………………………………………….13

1-6- عوامل تهدید و تخریب تالابها ………………………………………………………………13

1- 6-1- عوامل انسانی …………………………………………………………………………….13

1-6-2- تبدیل اکوسیستم های تالابی به زمینه ای کشاورزی………………………………..13

1-6-3- رودخانه ها و جریانات آبی آلوده …………………………………………………………14

1-6-4- رسوبات حمل شده به تالاب …………………………………………………………….14

1-6-5- عدم وجود مدیریتی هدفدار و توانمند…………………………………………………..14

1-6-6- استفاده از تالابها به عنوان مناطق تفرجگاهی………………………………………..14

1-7 – جوامع جلبكی در اكوسیستم های آبی………………………………………………..15

1-8- فیتوپلانکتون ها………………………………………………………………………………16

1- 9- رده های مهم فیتوپلانکتون ها…………………………………………………………..18

1- 9- 1- رده باسیلاریوفیسه یا دیاتومه ها……………………………………………………..18

1-9- 2- رده داینوفیسه ( داینوفلاژله ها )………………………………………………………..19

1-9- 3- جلبک های سبز پلانکتونی(رده کلروفیسه )………………………………………….20

1-9- 4- اوگلناهای تاژکدار(رده اوگلنوفیسه)…………………………………………………….21

1-9- 5- جلبک های قهوه ای- طلائی (رده (Chrysophyceae ……………………………….

1-9- 6- رده Prymnesiophyceae ………………………………………………………………

1-9- 7- رده کریپتوفیسه…………………………………………………………………………..22

1-9- 8- جلبك های سبز- آبی (رده سیانوفیسه یا سیانوباكترها)……………………………22

1-10-  جلبک های کف زی……………………………………………………………………..23

1-10-1-  فراوانی و پراکنش جلبک های کف زی……………………………………………….24

1-11- عوامل مؤثر بر ترکیبات جامعه وتولیدات جلبک های کف زی………………………….26

1-11-1- نور…………………………………………………………………………………………26

1-11-2- مواد مغذی…………………………………………………………………………………28

1-11-3- جریان آب………………………………………………………………………………….32

1-11-4- بستر………………………………………………………………………………………35

1- 11-5- دما………………………………………………………………………………………..36

1-11-6-  چرا……………………………………………………………………………………….37

1-12- تغییرات زمانی و مکانی در جلبک های کف زی………………………………………….37

1-13- ارزیابی کیفیت آب تالابها ها با بهره گرفتن از فیتوپلانکتون ها……………………………..39

1-14-  اهداف تحقیق……………………………………………………………………………….41

 فصل دوم:مواد و روش ها

2-1- مشخصات، موقعیت جغرافیایی و وضعیت اقلیمی منطقه…………………………………43

2-2-  حیات وحش…………………………………………………………………………………….45

2-3- خصوصیات رویشگاه ها و گسترشگاه های گیاهان در منطقه……………………………….45

2-4- وسایل و مواد مورد استفاده …………………………………………………………………..46

2-5- تعیین ایستگاه های نمونه برداری…………………………………………………………..47

2-6-  دوره های نمونه برداری………………………………………………………………………..48

2-7- روش های نمونه برداری………………………………………………………………………….48

2-8- تثبیت و آماده سازی نمونه ها………………………………………………………………49

 

 

2-9 – متغییرهای اندازه گیری شده در آزمایشگاه………………………………………………..50

2-9-1- روش اندازه گیری وزن زنده (Bio mass)………………………………………………….50

2-9-2- روش اندازه گیری وزن خشک (Dray mass) ……………………………………………50

2-9-3- روش اندازه گیری وزن خشک بدون خاکستر (A.F.D.M ) ……………………………….50

2- 9- 4- تعیین میزان کلروفیل a ………………………………………………………………….

2-10- شناسایی جلبکها…………………………………………………………………………….51

2-11- نحوه شمارش جلبک ها……………………………………………………………………..51

فصل سوم:نتایج

3-1- متغییرهای اندازه  گیری شده…………………………………………………………………54

3-1-1- تغییرات وزن زنده (Bio mass )………………………………………………………………..54

3-1-2- تغییرات وزن خشک (Dray mass) …………………………………………………….54

3-1-3- تغییرات وزن خشک بدون خاکستر(A.F.D.M) …………………………………………55

3-1-4- تغییرات میزان کلروفیل a (Chlorophylle a ) ……………………………………………

3-2- جامعه فیتوپلانکتونی ………………………………………………………………………….56

3-3- بررسی تاکسونومیکی فیتوپلانکتونها ……………………………………………………….57

3-4 – مقایسه نموداری  فیتوپلانکتون های  مشاهده شده در دو ایستگاه………………….60

3-4-1- مقایسه شاخه های ثبت شده ………………………………………………………….60

3-4-2-  مقایسه جنس های ثبت شده……………………………………………………………61

3-5- شرح برخی از شاخه ها و جنس های مهم مشاهده شده در تالاب زریبار…………….65

فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری

4-1- متغییر های اندازه گیری شده ………………………………………………………………..73

4-2- بحث نتایج تاکسونومیک فیتوپلانکتون ها ………………………………………………….73

4-3- پیشنهادات …………………………………………………………………………………….75

منابع ………………………………………………………………………………………………..77

چکیده:

شناسایی گونه ها و برآورد باردهی جوامع پریفیتونی دریاچه زریبار با هدف ارزیابی کیفیت آب از فروردین ماه 1392 تا مرداد ماه 1392 به مدت 6 ماه انجام شد. نمونه برداری در دو ایستگاه رودخانه ده ره تفه (شماره یک) و ایستگاه سدخاکی (شماره دو) توسط بسترهای سیمانی حاوی کاشی های شیشه ای صورت گرفت. همراه با شناسایی پریفیتون ها متغییرهای وزن زنده، وزن خشک، وزن خشک بدون خاکستر ( A.F.D.M) و میزان کلروفیل a مورد سنجش و ارزیابی قرارگرفت. در مجموع 43 جنس متعلق به 16 راسته و 8 شاخه مشاهده گردید. اعضای شاخه Bacillariophyceae  با داشتن 14 جنس بیشترین تعداد و تنوع را نشان دادند که جنس Navicula  در تمام مراحل نمونه برداری غالب بود. پس از آن شاخه Chlorophyceae  و Cyanobacteriaf به ترتیب با 10 جنس و 8 جنس در مرحله بعدی بودند. شاخه Dinophyceae  و Conjugatophyceae  هر کدام دارای 3 جنس بودند. Euglenophyceae  دارای 2 جنس و Cryptophyceae  و Xanthophyceae   فقط یک جنس داشتند. در میان جنس های مشاهده شده در دوره نمونه برداری Navicula  دارای بیشترین تعداد در هر دو ایستگاه بود. در ایستگاه ده ره تفه پس از Navicula  جنس های Diplonies  و Nitzschia در مرحله بعدی غالب بودند. در ایستگاه سدخاکی هم جنس های Epithemia  ،  Frustula و Ooedogonium   پس از Navicula  دارای بیشترین تعداد بودند. جنس های  Melosaria ، Aulacoseria ، Pinnularia ، Ooedogonium  ، Quadingula  ، Zygnema،   Staurastrum ، Raphidiopsis ، Chroococus ، Hetrocapsa  و Tribonema  فقط در ایستگاه سد خاکی ثبت و مشاهده شدند. جنس Cymbella  فقط در ایستگاه ده ره تفه ثبت گردید.  در کل تنوع و تعداد جنس ها در ایستگاه سد خاکی بیشتر از رودخانه ده ره تفه بود. دیاتومه ها در تمامی مراحل نمونه برداری قابل مشاهده بودند و در ماه های تیر ومرداد سیانوباکتریها غالب بودند. به نظر می رسد مجموعه ای از عوامل اقلیمی و فیزیکوشیمیایی بر چگونگی رشد و تکثیر فیتوپلانکتون ها، ترکیب گونه ای و فراوانی آنها در این دریاچه تأثیر بسزایی دارد. با توجه به تاکسون های شناخته شده چنین نتیجه گیری می شود که دریاچه زریبار جزء آبهای الیگو مزوتروف می باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- تالاب ها

تالاب ها به طور مستقیم یا به طور ضمنی و تلویحی به طرق گوناگون تعریف شده اند. عوامل متعدد ازقبیل دیدگاه و نظریات شخصی، جایگاه وموقعیت، چشم اندازها و مناظر، هر فرد یا گروهی تالاب  را از دیدگاه و نظریات خود متکی بر تجارب یا نیازهای خاص تعریف کرده است. برای مثال، اگر تعریف تالاب از یک  فرد عادی و غیر متخصص پرسیده شود، ممکن است که یک باتلاق با انبوهی از گیاهان با آب عمیق همراه با اردک ها و یا این که یک برکه ناشناخته و کدر  را بیان کند، اما از دیدگاه متخصص، تالاب به عنوان مکانی که در آن فرایند غیر هوازی رخ می دهد، به همراه  گیاهان  فراوانی که برای زندگی در شرایط مساعد، یا دشوار و طاقت فرسای آن ناحیه سازگار شده اند تعریف می شود. نهایتاً آنان که استفاده و کارایی های تالاب ها  را بیان و محاسبه میکنند مطمئنا یک نظریه ساختاری دارند و تالاب را به وسیله ویژگی های بارز خاک، هیدرولوژی و گیاهان آن به خاطر سهولت تصمیم گیری در مورد کاربری های آن تعریف  می کند.

2-1- تعریف تالاب

تالاب از نظر لغوی معادل واژه “ وتلند “ به معنی اراضی خیس و غرقابی و متشکل از دو کلمه تال و آب بوده که در اصل به معنی آبگیر می باشد. تالاب ها  زیستگاه هایی موقتی و انتقالی اند از این حیث که آنها نه زیستگاه های خشکی اند و نه زیستگاه های آبی، بلکه ویژگی ها و خصوصیات هر دو را دارند. ممکن است در طی زمان به خاطر وابستگی به فاکتور هایی نظیر میانگین بارش سالیانه، تبخیر و تعرق و تغییرات و اصلاحات حوضه آبریز، گسترده یا محدوده  شوند. به خاطر موقتی بودن خصوصیات تالاب ها  و جابجایی مرزهای آنها، شناسایی  دقیق مرز تالاب ها اگر عملاً غیر ممکن نباشد، مشکل خواهد بود. همچنین انواع مختلف تالاب در نوع تعریف آن مؤثرند. تالاب ها شامل زیستگاه های شناخته شده ای، مانند باتلاق  و مرداب و تالاب های فصلی که کمتر شناخته شده اند، مانند برکه های بهاری و رودهای دوره ای و فصلی می باشند.

هر تالاب بسته به اندازه، شکل، هیدرولوژی، خاک، گیاهان و موقعیتش در چشم اندازها منحصر به فرد می باشد. به همین دلیل تالاب ها دامنه وسیعی از ویژگی های عملکردی وکارا و مفید، شامل : 1- تهیه زیستگاه هایی برای حیات وحش و آبزیان 2- حفظ و نگهداری رسوبات و سموم 3- تضعیف قدرت تخریب سیلاب 4- متابولیسم مواد غذایی 5- تغذیه آبهای زیرزمینی 6- صدور محصولات را ارائه می کنند.

علی رغم این که ارائه تعریف برای تالاب به صورت جامع کاملاً دشوار است، تاکنون چندین تعریف رسمی پیشنهاد شده است. آسانترین تعریف را مدیران و دانشمندان بویژه آنهایی که علاقمندن به پرندگان آبزی و حیات وحش می باشند، بیان نمو ده اند (F. Shaw 1956). این تعریف که تا اندازه ای تعریف ساختاری است و مطلبی قابل فهم و کلامی معقول را برای افراد عادی  ارائه می دهد. واژه تالاب به زمین های پستی اطلاق می شود که با آب کم عمق ( پایاب) و گاهی اوقات آبهای موقتی و فصلی پوشیده شده اند. همچنین با اسامی دیگری مانند, wet Meadow , Bog ,fen swamp , marsh , potholes  نامیده می شود.

این تعریف برپایه دو پارامتر ضروری که باید در یک تالاب وجود داشته باشد، بیان شده است :

1- وجود آب های سطحی 2- توسعه و گسترش رطوبت درخاک برای گیاهان

دریک کارگروه کانادایی، یک گروه محقق تالاب های ملی آن کشور، تعریفی را ارائه کرده که پارامتر سومی یعنی خاک های هیدریک را هم شامل شده است. این تعریف بیشتر به  خصوصیات علمی تالاب ها توجه کرده است. به علاوه توضیح  و بسط تعریف قبلی  تالاب که نه تنها شامل زیستگاه هایی که دارای آب های سطحی می باشند، می پردازند، بلکه آنهایی را که خاک اشباع شده دارند، را تشریح می کنند (Tarnokai- 1979).

سرویس حیات وحش  و ماهیان آمریکا، تعریفی را که هیدرولوژی تالاب، خاک های  هیدریک و گیاهان آبدوست را به عنوان پارامترهای دخیل در تعریف تشخیص داده، تصویب نموده است (Kvardyn et al, 1979). این تعریف  تالاب شناسان، تعریفی است که از تعریف کانادایی ها، از این حیث که نیاز به ارائه  ویژگی و خصایص  پارامتر مذکور را ندارد، متمایز گردیده است :

تالاب ها، زمین های موقتی بین سیستم های خشکی و آبی هستند. مکانی که سفره آب در درون یا نزدیک به سطح زمین قرار دارد و یا بوسیله آب های کم عمق پوشیده شده است.

1-2-1- تعریف تالاب از نظر کنوانسیون رامسر

مناطق مردابی، آبگیر، توربزا  برکه های مصنوعی یا طبیعی که به طور دائم یا موقت دارای آب ساکن یا جاری، لب شوریا شور مشتمل بر مناطقی از آبهای دریایی که عمق آب هنگام پایین ترین جزر در آنها  بیش از6 متر نباشد.

3-1- طبقه بندی تالاب

روش ها و الگوهای طبقه بندی تالاب ها بسیار توسعه یافته اند (For example, Martin and Stewart et al 1953 and 1971 Kantvrd Glt and Larson 1974). این سیستم طبقه بندی بوسیله کاردین و همکارانش در سال 1979 گسترش  یافت و در سال  1993 بوسیله آقای برینسون که از سوی دانشمندان، سیاستمداران  و مهندسین مورد  تأیید قرار گرفت، به صورت پیشرفته ارئه گردید. این طبقه بندی ها می توانند درتمام نواحی جغرافیایی و در قسمت اعظم دنیا  بیشتر از سایر طرح های طبقه بندی به کار روند.

با توجه به ویژگیهای متفاوتی که تالابها می توانند داشته باشند سیستم های طبقه بندی  متعددی برای تالابها ارائه شده است. معمولاً در این نوع طبقه بندی ها معیارهای گوناگونی نظیر رویش های گیاهی، ویژگیهای هیدرولوژیک، خصوصیات شیمیایی، نوع خاک و هیدروتوپوگرافی منطقه اساس طبقه بندی تالابهای مختلف قرار می گیرد. بنابراین فقط به برخی از طبقه بندی های مهم در رابطه با تالابها در نقاط مختلف دنیا اشاره می شود. هر چند بیشتر سیستم های طبقه بندی تالاب بر روی مفهوم هیدرولوژی تکیه می کنند ولی سیستم های اولیه ای که در ارتباط با طبقه بندی تالاب ارائه شدند برمبنای رویش های گیاهی نظیر جنگلی، همیشه سبز، برگ ریز و غیره استوار بودند، که البته این سیستم ها هنوز هم  برای توصیف و تشریح ساده از تالاب بسیار مفید می باشند.

 در دهه 1970 طبقه بندیهای فراوانی از تالاب ارائه شد که یکی از مهمترین آنها را ادوم ( 1971, Odum ) بر اساس موقعیت جغرافیایی قرارگیری تالابها و شرایط محیطی تأثیر گذار بر آنها ارائه نموده است.

 بر طبق طبقه بندی ادوم تالابها به پنج گروه تقسیم می شوند :

نوع اول : سیستم هایی که سازگار به شرایط مختلف محیطی بوده بدین لحاظ دارای محدوده وسیعی از پراکنش جغرافیایی می باشند.

نوع دوم : اکوسیستم های نواحی حاره و استوایی که در این اکوسیستم های هر چند میزان نور بالا بوده ولی تغییرات محیطی و فصلی بسیار ناچیز می باشند  از جمله این اکوسیستم ها می توان به سیستم های  حرا اشاره نمود.

نوع سوم : اکوسیستم های نواحی معتدله که شدیداً تحت تأثیر تغییرات فصلی نظیر سرمای زمستان و گرمای تابستان می باشند.

نوع چهارم : اکوسیستم های واقع در نواحی قطبی

نوع پنجم : اکوسیستم های جدیدی که در مجاورت جوامع بشری بوجود آمده اند و شدیداً تحت تأثیر دستکاریهای بشر در حال تغییر می باشند.                                                                               

یکی از مهمترین سیستم های تالابی که همیشه درمورد آن مباحث زیادی بیان می گردد، توربزارها می باشد. اقدامات مربوط به طبقه بندی  توربزارها در شمال اروپا و آمریکا انجام شده که طبقه بندی Davis (1907)                                                                                     در ایالات متحده از اولین طبقه بندیهای ارائه شده در رابطه با توربزارها می باشد وی باگهای میشیگان را بر طبق سه اصل ذیل گروه بندی نمود :

1-  زمین های باگ یا بر روی دریاچه های کم عمق یا بر روی دلتاهای رودخانه ایی واقع شده اند.

2-  باگ ها از دوطریق توسعه می یابند یا با بالا آمدن کف سیستم و یا گسترش نواحی ساحلی به سمت دریا

3-  سطح آنها یا از خزه و یا از لاریکس پوشیده شده است.

ویلر نیز (Wheller – 1994) انواع تالاب ها را بر اساس منبع تأمین آب، چگونگی کسب رطوبت و همچنین مکان جغرافیایی آنها گروه بندی نموده است که در زیر به اختصار آورده شده است :

بر اساس منبع تأمین آب : دریاچه ها، آبهای زیرزمینی، نهرهای جاری شده از آبهای جاری

تالابهای واقع بر مناطق بدون شیب : انواع تورب زارها، تالاب مردابی، تالاب چاهی

تالابهای واقع بر مناطق شیب دار : فن های چشمه ای، فن های شیب دار، باگ تپه ای

یکی دیگر از نظام های طبقه بندی که امروزه در رابطه با تالاب ها مطرح است طبقه بندی Brinson (1993) می باشد  وی تالاب را بر اساس ویژگیهای هیدروژئومورفیکی تقسیم بندی نموده است، او در طبقه بندی خود به سه فاکتور ژئومورفولوژی منطقه ( موقعیت جغرافیایی تالاب )، منابع آب تالاب و خصوصیات هیدرو دینامیکی آب تالاب ( جهت و قدرت حرکت آب تالاب ) توجه داشته است که به این تقسیم بندی در زیر اشاره شده است :

بر اساس ژئوموفولوژیکی ( موقعیت جغرافیایی تالاب ) : گودالها ( برکه های بهاری ) تورب زارها ( باگ فن)، حواشی رودخانه ها و برخی اکوسیستم های دیگر ( کرانه ها).

بر اساس منبع تأمین آب : بارندگی ( باگ امبروتر وفیک )، آبهای زیرزمینی ( فن ها)، آبهای  سطحی (تالاب ساحلی ).

بر اساس ویژگیهای هیدرودینامیکی : نوسانات عمودی ( باگ )، جریانهای یک طرفه ( تالابهای کنار رودها).

بنابراین کاملاً مشخص است که طبقه بندی  تالابها در نقاط مختلف جهان بر اساس معیارهای بسیار متنوعی صورت می گیرد و در این مورد نیز اتفاق نظری وجود ندارد و متناسب با نوع ویژگی یک تالاب و یا اعمال نظر شخصی یک دانشمند یا سازمان این تقسیم بندی  انجام می شود.

Beazly درسال 1993 درکتاب ” تالابها در معرض خطر” انواع تالابهای موجود در نقاط مختلف جهان را در شش سیمای عمده به صورت زیر معرفی کرد.

1- مصب ها، سیستم های حرا و کفه های گلی (Estuaris ‘ Mangroves and tidal flate) : از مهمترین ویژگی این اکوسیستم ها بویژه مصب ها حرکت روزانه جزر و مد می باشد. در محل مصب ها به دلیل تداخل آب شیرین رودخانه با آب شور دریا ها چشمه هایی با آب لب شور ایجاد شده است. 

2- دشت های سیلابی و دلتاها (Flood plain and deltas) : این زیستگاها عمدتاً تحت تأثیر طغیان آب رودخانه ها بوده و بر این اساس الگوی تغذیه ایی آب در آنها به صورت فصلی می باشد. دشتهای سیلابی عموماً در نواحی ساحلی و