1-1- مقدمه و هدف…………………………………. 2

1-2-کلیات………………………………………… 3

1-2-1- نقش آب در اعمال گیاهان………………………. 3

1-2-2- تنش……………………………………….. 4

1-2-3- تنش خشکی…………………………………… 5

1-2-4- جنگل­های زاگرس………………………………. 6

1-2-5- بلوط………………………………………. 8

1-2-6- اثر تنش خشکی بر خصوصیات مورفولوژیکی درختان…….. 9

1-2-6-1- تعداد برگ……………………………….. 10

1-2-6-2- رشد ریشه و ساقه………………………….. 11

1-2-6-3- بیوماس………………………………….. 12

1-2-7- پارامتر­های فیزیولوژیک و تاثیر تنش خشکی بر روی آن­ها 12

1-2-7-1- محتوای نسبی آب…………………………… 13

1-2-7-2- عملکرد فتوسیستم ∏………………………… 14

1-2-7-3- نرخ نشت الکترولیت………………………… 14

1-2-7-4- تبادلات گازی……………………………… 15

1-2-7-5- فتوسنتز…………………………………. 16

1-2-7-6- تعرق……………………………………. 16

1-2-7-7- هدایت روزنه­ای……………………………. 17

1-2-7-8- عناصر غذایی……………………………… 17

1-2-7-8-1- نقش فسفر………………………………. 18

1-2-7-8-2- نقش پتاسیم…………………………….. 18

1-2-7-8-3- نقش سدیم………………………………. 19

1-2-7-8-4- نسبت سدیم به پتاسیم………………… 20

1-2-8- نشانگر مولکولی…………………………….. 20

1-2-8-1- نشانگر مولکولیAFLP……………………….. 23

1-2-9- واکنش زنجیره­ای پلی­مراز PCR)) ………………… 25

1-2-10- بیان ژن………………………………….. 26

1-2-10-1- مراحل مختلف بیان ژن……………………… 27

1-2-11- واکنش نسخه­برداری معکوس (RT)………………… 28

1-2-11-1- PCR همراه با نسخه­برداری معکوس (RT-PCR………. 28

فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده

2-1- ویژگی­های مورفولوژیک و رویشی…………………… 30

2-2- ویژگی­های فیزیولوژیکی…………………………. 31

2-2-1- محتوای نسبی آب…………………………….. 31

2-2-2- عملکرد فتوسیستم ∏………………………….. 32

2-2-3- نشت الکترولیت……………………………… 34

2-2-4- فتوسنتز و هدایت روزنه­ای…………………….. 34

2-3- جذب عناصر…………………………………… 35

2-4- شناسایی ژن­های مرتبط به خشکی با بهره گرفتن از cDNA- AFLP. 36

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- نحوه جمع آوری و کاشت بذر گونه­ های مورد مطالعه……. 40

3-2- روش اعمال تنش کمبود آب و برداشت نهال­ها…………. 40

3-3- اندازه­ گیری پارامتر­های مورفولوژیکی و رویشی……… 41

3-4- اندازه ­گیری پارامتر­های فیزیولوژیک………………. 42

3-4-1- اندازه ­گیری محتوای نسبی آب…………………… 42

3-4-2- اندازه گیری عملکرد فتوسیستم ∏……………….. 42

3-4-3- اندازه ­گیری نرخ نشت الکترولیت………………… 42

3-4-4- اندازه ­گیری تبادلات گازی……………………… 44

3-4- 5- اندازه ­گیری سدیم و پتاسیم قابل جذب توسط گیاه….. 44

3- 5- مطالعات مولکولی…………………………….. 46

3- 5- 1- استخراج RNA……………………………… 46

 

3- 5-2- تهیه ژل آگارز- (یک درصد)…………………… 47

3-5-3- تهیه loding day………………………………. 47

3- 5-4- تهیه MOPS [1X] (محلول تانک)………………… 48

3- 6- تجزیه و تحلیل داده ­ها………………………… 48

3-6-1- اندازه ­گیری شاخص تحمل (STI)…………………… 49

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- نتایج وبحث پارامتر­های رویشی…………………… 50

4-2- نتایج و بحث پارامتر­های فیزیولوژیک……………… 53

4-3- نتایج و بحث جذب عنصر…………………………. 55

4-4- نتایج و بحث شاخص تحمل………………………… 59

4-5- نتایج و بحث فتوسنتز……………………….. .. 60

4-6- نتایج و بحث همبستگی تبادلات گازی……………….. 63

4-7- نتیجه ­گیری کلی و پیشنهادات…………………….. 67

4-7-1- نتیجه ­گیری کلی……………………………… 68

4-7-2- پیشنهادات…………………………………. 69

منابع و مآخذ…………………………………….. 70

پیوست…………………………………………… 87

 

فهرست جدول­ها

جدول 1-1- مهمترین نشانگر­های dna با مزایا و محاسن آن­ها… 23

جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) صفات رویشی و مورفولوژیک مورد بررسی……………………………………………….. 51

جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات رویشی و مرفولوژیک مورد بررسی در دو گونه مورد مطالعه……………………………………………….. 51

جدول4-3- مقایسه میانگین صفات رویشی و مرفولوژیک مورد بررسی در تیمار­های آبی مختلف 52

جدول4-4- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) صفات فیزیولوژیکی مورد مطالعه 53

جدول4-5- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی در دو گونه مورد مطالعه 53

جدول4-6- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی در تیمار­های آبی مختلف  54

جدول4-7- نتایج تجزیه واریانس(مقایسه میانگین) جذب عنصر… 58

جدول4-8- مقایسه میانگین جذب عنصر در دو گونه مورد مطالعه. 56

جدول4-9- مقایسه میانگین جذب عنصردرتیمار­های آبی مختلف…. 56

جدول4-10- شاخص تحمل به تنش (STI) در دو گونه مورد مطالعه.. 59

جدول4-11- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) صفات مورد مطالعه………………………………………………………………………61

جدول 4-12- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در دو گونه مورد مطالعه…………………………………………………………………..61

جدول 4-13- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در زمان­های مختلف…………………………………………………………………………62

جدول 4-14- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در تیمار­های آبی مختلف………………………………………………………………….62

جدول 4- 15- نتایج همبستگی پارامتر­های تبادلات گازی در گونه وی­ول………………………………………………………………………63

جدول 4-16- نتایج همبستگی پارامتر­های تبادلات گازی در گونه بلوط ایرانی……………………………………………………………….64

 

فهرست شکل­ها

شکل1-1- واکنش زنجیره­ای پلی­مراز…………………….. 26

شکل 1-2- رونویسی…………………………………. 27

شکل1-3- پردازش…………………………………… 27

شکل 1-4- ترجمه…………………………………… 28

شکل 1-5- نسخه برداری ­معکوس………………………… 29

شکل 4-1- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت پتاسم برگ…. 57

شکل4-2- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت سدیم برگ…… 57

شکل4-3- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت سدیم ریشه….. 58

شکل 4-4- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت نسبت سدیم به پتاسیم برگ   58

شکل 4-5- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت نسبت سدیم به پتاسیم ساقه  58

شکل4-6- تصویر ژل بار­گذاری شده…………

چکیده

جنگل­های زاگرس حدود40 درصد از کل جنگل­های ایران را به خود اختصاص داده اند و بیشترین تأثیر را در تأمین آب، حفظ خاک، تعدیل آب و هوا و تعادل اقتصادی– اجتماعی در کل کشور دارند. این جنگل­ها به علت دارا بودن اقلیم مدیترانه­ای دارای فصل خشک طولانی در طی دوره­ رویش گیاهی در طول سال بوده، و مقدار آب در دسترس در این جنگل­ها یک فاکتور محدود کننده­ی اولیه در تجدید حیات گونه­ های این مناطق می­باشد. تنش­های غیر زیستی مانند خشکسالی پدیده­های مهمی هستند و بر روی سلامت، بهره­وری و تناسب جنگل­های ما اثر گذار می­باشند، بنابراین نیازمند به درک ژنومی و اکوفیزیولوژیکی پاسخ درختان جنگلی به تغییر شرایط آب و هوایی می­باشد. با بهره گرفتن از مطالعات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و مولکولی، می­توانیم روش­های اصلاحی مختلفی که برای مقاومت به خشکی وجود دارند را شناسایی کنیم. در این آزمایش، بذور سه گونه بلوط مورد مطالعه (Q. brantii، Q.libania و Q.infectoria) در داخل گلدان پلاستیکی در فضای آزاد کاشته شدند (هرگلدان حاوی 2-1 بذر). نهال­های گونه Q.infectoria به علت سبز نشدن در این آزمایش لحاظ نگردید. جهت اعمال تنش نهال­ها به فضای گلخانه منتقل شدند و نهال­های سالم از هر گونه به 4 دسته تیمار کنترل و تنش کمبود آب در سه سطح تقسیم شدند. نهال­های در نظر گرفته شده برای تنش کمبود آب آبیاری نشدند تا به ظرفیت مزرعه­ای مورد نظر (70٪، 50٪ و 30٪ ظرفیت مزرعه­ای) رسیدند، ولی نهال­های کنترل هر روز آبیاری گردیدند تا محتوی آب خاک گلدان­ها در حدود 100٪ ظرفیت مزرعه­ای نگه داشته شود. پس از برداشت نهال­ها، پارامترهای رویشی و مورفولوژی (ارتفاع نهال، طول ریشه، وزن برگ و ساقه و ریشه، تعداد کل برگ، نسبت برگ سبز به کل برگ، بیوماس، نسبت ریشه به ساقه، وزن خشک برگ، ریشه و ساقه) و پارامترهای فیزیولوژی (محتوی نسبی آب برگ و ساقه و ریشه (RWC)، نرخ نشت الکترولیت (EL)، عملکرد فتوسیستم II و تبادلات گازی) اندازه ­گیری شدند و در نهایت استخراج RNA از نمونه­های فریز شده برگ و ریشه انجام گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که تنش خشکی تاثیرات منفی بر پارامتر­های رویشی، مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی بلوط داشت، به طوری که اکثر پارامترهای رویشی و فیزیولوژیکی کاهش یافت اما نرخ نشت الکترولیت اندام­ها افزایش یافت. بر اساس نتایج بدست آمده از جذب عنصر تنش خشکی باعث افزایش میزان

پتاسیم در ریشه و ساقه گردید. همچنین نتایج نشان داد که میزان شاخص تحمل نیز در گونه بلوط ایرانی در تمام پارامتر­های مورد مطالعه به جز وزن تر و خشک برگ بیشتر از گونه وی­ول می­باشد. در این مطالعه گونه بلوط ایرانی نسبت به گونه وی­ول با جذب سدیم کمتر برگ و در نتیجه نسبت سدیم به پتاسیم کمتر و نیز کاهش تعداد برگ توانست تحمل بهتری را از خود نشان دهد. پارامترهای مربوط به تبادلات گازی نشان داد که تیمار تنش کمبود آب سبب کاهش معنی­داری در هدایت روزنه­ای، فتوسنتز، هدایت مزوفیلی و دی­اکسیدکربن زیر روزنه­ای به محیطی و تعرق شد. همچنین گونه وی­ول فتوسنتز، کارایی مصرف آب و تعرق بیشتری نسبت به بلوط ایرانی داشت. به طور کلی می­توان نتیجه ­گیری کرد که در هر دو گونه محدودیت روزنه­ای و غیر روزنه­ای باعث کاهش فتوسنتز گردید. همچنین گونه بلوط ایرانی به دلیل داشتن کارایی مصرف آب کمتر و کاهش بیشتر درصد تغییرات پارامتر­های گازی نسبت به گونه وی­ول از مکانیسم اجتناب از خشکی در زمان تنش بهره می­جوید. اما در مورد مطالعات مولکولی عمل استخراج RNA  صورت گرفت مرحله run کردن نمونه نیز انجام شد ولی در مرحله الکتروفورز به علت مشاهده نشدن نوار­های مربوط بهRNA  مطالعات مولکولی موفقیت­آمیز نبود.

 

1-1- مقدمه و هدف

جنگل­­های زاگرس از گسترده­ترین اکوسیستم­های جنگلی در حال تخریب در ایران می­باشند و دومین اكوسیستم طبیعی بعد از جنگل­های شمال محسوب می­شوند که از لحاظ حفاظت آب و خاک و مسائل اقتصادی، اجتماعی اهمیت بالایی دارد (حسینی و همکاران، 1387). بنابراین احیاء و غنی­سازی این جنگل­ها با گونه­ های مختلف جنس بلوط که مهمترین جنس تشکیل دهنده آن است، ضروری می­باشد (ذوالفقاری، 1387). اما جنگل­های زاگرس به دلیل داشتن اقلیم مدیترانه­ای، دارای فصل خشک طولانی در طی دوره­ رویش گیاهی و پراکنش نامنظم بارندگی در طول سال هستند و در نتیجه مقدار آب در دسترس این جنگل­ها به عنوان یک فاکتور محدود کننده اولیه در تجدید حیات گونه­ ها به ویژه بلوط محسوب می­ شود. طبق نظر محققین جنگل­های بلوط غرب در زمره جنگل­های خشکی­گرا هستند. سه گونه­ بلوط در کل زاگرس وجود دارد که هر 3 گونه بومی ایران می­باشند و مورد قبول اکثر گیاه شناسان ایران است. این گونه ها شاملQuercus infectoria  و Quercus libania  و  Quercus brantii می­باشند (جزیره­ای و ابراهیمی، 1382).

بر اساس مناطق رویشی، رویشگاه گونه­ های مختلف زاگرس را به دو بخش متمایز تحت عنوان زاگرس شمالی و زاگرس جنوبی تقسیم نموده ­اند. زاگرس شمالی رویشگاه ویژهQuercus libani Olivier  است كه البته در قسمت ­هایی از این حوزه با Q. infectoria Olivier یاLindl  Q. brantii یا با هر دو مخلوط می­گردد. اما زاگرس جنوبی که دارای اقلیم خشک­تری نسبت به زاگرس شمالی است، رویشگاه ویژه گونه Q. brantii است (جزیره­ای و ابراهیمی، 1382).

تنش­های غیر زیستی مانند خشکسالی پدیده­های مهمی هستند و بر روی سلامت، بهره­وری و تناسب جنگل­های ما اثر گذار می­باشند، بنابراین نیازمند به درک ژنومی و اکوفیزیولوژیکی پاسخ درختان جنگلی به تغییر شرایط آب و هوایی می­باشد (راجورا و همکاران، 2011). کمبود آب، یک مشکل جهانی رو به افزایش است. کمبود آب تولید بسیاری از اکوسیستم­های طبیعی را مخصوصاً در اقلیم­های خشک محدود می­ کند. به علاوه تنش آبی به عنوان مهمترین تنش غیرزیستی نقش مهمی در کاهش تنوع ژنتیکی و عملکرد گیاهان در جهان دارد (كوچكی و همكاران،1384).  هر چند جنگل­های غرب ایران از نظر وسعت بیشترین سطح جنگل­های کشور را داراست، اما از نظر اقتصادی (تولید چوب) بعد از جنگل­های شمال کشور قرار دارد و نقش اصلی این جنگل­ها حفاظت از آب و خاک است که نباید نادیده گرفته شود. بنابراین به منظور احیاء جنگل­های غرب کشور به ناچار باید از گونه­های سازگار و بومی جنگل­های زاگرس استفاده گردد (فتاحی،1378).

بارتلس و سانکار (2005) بیان کردند که خشکی علاوه بر ایجاد تغییرات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی، در سطح مولکولی نیز تغییراتی را به­وجود می­آورد. تا امروزه مطالعات کمی در زمینه­ تنش­های محیطی بر روی درختان جنگلی صورت گرفته که هدف اصلی آ­­نها شناسایی و ایجاد واریته­هایی است که بتوانند به خوبی در برابر تنش­ها از خود مقاومت نشان داده و محصول بیشتری تولید نمایند. از این­رو استفاده از فن­های جدید جهت انجام مطالعه بر روی تنش­ها­ی محیطی امر­ی اجتناب ناپذیر بوده و از لحاظ اقتصادی نیز قابل توجیه است (خویدکی، 1389). با بهره گرفتن از مطالعات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و مولکولی، می­توانیم روش­های اصلاحی مختلفی که برای مقاومت به خشکی وجود دارند را شناسایی کنیم (نوروزی، 1383).

بررسی­ها نشان داده که زادآوری طبیعی جنس بلوط اغلب با مشکلاتی مواجه است (تادانی و همکاران، 1995) و کیفیت پایین نهال­های بلوط نیز جنگل­کاری با این گونه را با مشکل روبرو کرده است (کلارکو همکاران،2000)، بنابراین مطالعه خصوصیات مورفولوژیکی و رویشی (ریچ و همکاران، 1992) و همچنین مشخصات فیزیولوژیک (جذب و انتقال و فتوسنتز) روی مقاومت گیاه در برابر خشکی دارای اهمیت بسیار می­باشد و بر این اساس است که اختلاف در استراتژی مقاومت به خشکی در گیاهان در گونه­ ها یا اکوتیپ­های مختلف وجود دارد (لویا و فرناندزالس ، 1998).

امروزه روش­هایی استفاده می­ شود که می­توانند اظهار متفاوت ژن­ها را در بین نمونه­های آزمایشی شناسایی کنند. یکی از بهترین این روش­ها cDNA-AFLP می­باشد که این روش به دلیل ­تکرارپذیری و حساسیت بالا، به وفور مورد استفاده قرار می­گیرد (باچم و همکاران، 1996). روشcDNA – AFLP به ما اجازه می­دهد تا اظهار متفاوت از رونوشت­ها را با بهره گرفتن از PCR تشخیص دهیم.

با توجه به مطالب گفته شده در بالا و اهمیت روز افزون خشکی و تخریب جنگل­های زاگرس و عدم موفقیت در جنگل­کاری­ها، تحقیق حاضر در نظر دارد به بررسی و مطالعه پاسخ­های مرفولوژیکی، فیزیولوژیکی و ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگر مولکولی cDNA-AFLP، نهال­های سه گونه بلوط ایرانی، دارمازو و وی­ول نسبت به تنش خشکی به منظور شناخت عکس­العمل­های گونه­ های مختلف بلوط با تنش کمبود آب، بپردازد.

 

سوالات اصلی این پژوهش به شرح ذیل می­باشد:

• آیا تنش خشکی باعث ایجاد تفاوت الگو­های باندی اظهار شده cDNA-AFLP در سه گونه بلوط زاگرس، نسبت به کنترل می­ شود؟
• آیا شدت تنش خشکی یا تیمار­های آبی مختلف در بروز الگو­های باندی و نوع الگو­های موثر است؟
• آیا ­بافت­های ریشه و برگ از نظر نوع الگو­های باندی در واکنش به خشکی متفاوت هستند؟
• آیا گونه­ های مختلف بلوط زاگرس از نظر پاسخ به پارامتر­های مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و جذب عناصر با هم تفاوت دارند؟