چکیده:

اطلاعات زیادی در مورد توالی بسیاری از ژن ها بدون آنکه عملکرد آن ها شناخته شده باشد، وجود دارد. از این رو تحقیقات فراوانی از طریق روش­های معکوس ژنتیکی برای پر کردن شکاف بین ساختار و عملکرد این توالی­ها انجام گرفته است. تحقیق حاضر با هدف تعیین تنوع آللی ژن­های کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپ­های جو در سطح تک نوکلئوتید (SNP)، جستجوی آلل­های جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپ­های مورد مطالعه با بهره گرفتن از تنوع نوکلئوتیدی، و طبقه ­بندی ژنوتیپ­های آزمایشی در قالب گروه­های هاپلوتیپی انجام گرفته است. در این تحقیق از 96 ژنوتیپ جو که در مناطق مختلف شور در جهان از جمله ایران کشت می­گردند، به عنوان مواد گیاهی استفاده گردید. این تحقیق با همکاری مرکز بین ­المللی تحقیقات کشاورزی در مناطق خشک  (ICARDA) و پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران- کرج (ABRII) انجام گرفته است. ژن­های مورد مطالعه شامل دو ژن مقاوم به شوری در جو، CBL4 و HKT1، بوده است. از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی­یابی برای یافتن تنوع آللی در این ژن­ها در سطح تک نوکلئوتید استفاده شده است. نتایج حاصل از این آزمایش فراوانی نسبی موتاسیون تک نوکلئوتیدی در این ژن­ها را به ترتیب 9/17  SNP/Kb و 137 SNP/Kb در HKT1و CBL4 نشان داده است. مجموع موتاسیون­های مشاهده شده در ژن CBL4 بیش از ژن HKT1 بوده اما تعداد موتاسیون­های هموزیگوت، که دارای اهمیت بسیار زیادی در مطالعات ژنتیکی می­باشند، در ژن HKT1 اندکی بیشتر از ژن CBL4 بوده است. روابط فیلوژنی میان ژنوتیپ­ها در بررسی ژن HKT1 بیانگر وجود قرابت ژنتیکی زیاد میان آن­ها بوده است. در حالی که، مطالعه این روابط در ژن CBL4 وجود درخت­های فیلوژنی مجزا برای هر کانتیگ از این ژن و تفاوت ژنتیکی نسبتاً زیاد بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه را نشان داده است. آنالیز هاپلوتیپی ژن­های CBL4 و HKT1، عدم گروه­بندی هاپلوتیپی در ژن HKT1 و وجود سه گروه هاپلوتیپی مجزا در ژن CBL4 را نشان داده است. پنج ژنوتیپ از مجموع هفت ژنوتیپی که در این سه گروه هاپلوتیپی قرار گرفته­­اند متعلق به ایران می­باشند. گروه هاپلوتیپی اول متشکل از سه ژنوتیپ، دو ژنوتیپ ایرانی و دیگری رقم شاهد، می­باشد. رقم شاهد در این تحقیق، رقم کلیپر جو، یک رقم بسیار مقاوم به شوری است. بنابراین استنباط می­گردد که این دو رقم ایرانی نیز دارای سطح بالایی از مقاومت به شوری باشند. همچنین طبقه ­بندی ژنوتیپ­های ایرانی در گروه­های مختلف هاپلوتیپی نشان دهنده وجود تنوع ژنتیکی معنی­دار بین ارقام ایرانی است که دارای اهمیت ژنتیکی بسیار زیادی می­باشد. آنالیز هر دو ژن در ژنوتیپ­های مورد آزمایش در این تحقیق وجود رابطه ژنتیکی بسیار نزدیک بین ارقام ایرانی به استثنای چند مورد را نشان داده است. دلیل این امر منشأ ژنتیکی بسیار متفاوت این ارقام ایرانی بوده است. همچنین، از میان ارقام خارجی، ارقامی که متعلق به کشور لیبی و مقاوم به شوری بوده ­اند رابطه ژنتیکی بسیار نزدیکی با ارقام ایرانی نشان داده و در اکثر موارد در یک گروه اصلی و یا حتی در یک زیر گروه با ارقام ایرانی قرار گرفته­اند. بنابراین می­توان استنباط نمود که این ارقام قرابت ژنتیکی زیادی با یکدیگر داشته و از نظر فنوتیپی نیز می­توانند سطوح مشابهی از مقاومت به شوری را نشان دهند.

مقدمه:

افزون بر 20% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی می­باشد (28). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار می­دهد (51). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (15). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنش­های زنده و غیر زنده بیش از 50% کاهش می­یابد (146). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند 1) عدم تعادل یونی 2) کمبود مواد معدنی 3) تنش اسمزی 4) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو می­گردد (64). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل می­یابد (134) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش می­دهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی می­باشد (84). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: 1- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیت­ها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، 2- استفاده از موتاسیون­هایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن می­گردند برای شناسائی و مطالعه ژن­های مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (6)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و 3- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (154)، برنج (77 و 155) و سیب زمینی (93) می­باشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک می­ کند (27). افزایش گیاهان متحمل (124) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (111). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت می­گردد (112 و 20). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت می­ کند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک می­نماید (94). 

جو یکی از متحمل­ترین گیاهان زراعی است که طی سال­ها، از روش­های مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (149). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار می­باشد (105). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد می­یابند دارای تنوع ژنتیکی گسترده­تری هستند (88). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (69). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه می­باشد (15 و 138). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساس­ترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی می­باشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش می­­یابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (134)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی می­باشد (74). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانه­زنی و گیاهچگی هیچ رابطه­ای وجود ندارد (74). مکانیسم­های تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: 1- انتقال یون سدیم از برگ­های گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون می­ شود (38) و 2- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگ­های جو به داخل سلول­های مزوفیل نسبت به توزیع آن­ها در سلول­های اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلول­های مزوفیل می­ شود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (56).  

استراتژی­ های حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژن­های کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (65).   

دو ژن CBL4 و HKT1 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارند که نقش و اهمیت آن­ها به طور خلاصه ذکر می­گردد. سیگنال­های حاصل از یون کلسیم، مبدَل­ها و تنظیم کننده­ های اصلی در فرایندهای سازگاری و نموَی گیاهان هستند. این سیگنال­ها به واسطه اثرات تحریکی خاص ناشی از فعال شدن همزمان کانال­ها، پمپ­ها و انتقال دهنده­هایی که به صورت دمائی و فضایی افزایش یون کلسیم را نشان می­دهند، بروز می­یابند (59). مشخص­ترین مسیر سیگنال­دهی که مختص تنش شوری است نیز شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول می­باشد (161). در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتمالاً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4 که اصولاً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده می­ شود. کمپلکس CBL4/CIPK24 (SOS3/SOS2) از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کووالانسی تشکیل می­دهد (Ishitani, 2000) که موجب فسفریلاسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na+/H+ موجود در بخش مرزی غشاء  یعنی SOS1 می­گردد (104، 106 و 126). سیستم سیگنال­دهی CBL/CIPK برای ترجمه سیگنال­های یون کلسیم به شکل فسفریلاسیون پروتئینی است که کمپلکس­های شرکت کننده در پروتئین­های CBL و CIPK هایی را که با آن­ها اثر متقابل دارند، مانند AKT1، ترانسپورتر یون پتاسیم در آرابیدوپسیس یا SOS1، عامل حساسیت عمومی نسبت به شوری یا CHL، ترانسپورتر نیترات یا AHA2 و H+ATPase 2 در آرابیدوپسیس، را مشخص می­ کند (86). چند نوع CBL وجود دارد مانند CBL1، CBL4 و CBL9، که با اعضای غشائی در ارتباط هستند (54 و 68). در مورد CBL4/SOS3، نشان داده شده است که مریستوله شدن برای تحمل به شوری مهم و ضروری بوده است (54). اولین CBL شناخته شده با روش ژنتیکی SOS3/CBL4 بوده است. این نشان می­دهد که SOS3/CBL4 در تحمل به شوری از طریق حس­گر یون کلسیم دارای نقش اختصاصی می­باشد. ژن­هایی که گیاه را قادر به محدود کردن تجمع یون سدیم در بافت شاخه می­نمایند دارای منابع بالقوه­ای از تحمل نسبت به شوری در اصلاح نباتات هستند. در جو، لوکوس HvNaX4 مقدار یون سدیم در شاخه را بین 12 و 59 درصد کاهش می­دهد. بسته به شرایط هیدروپونیک و نوع خاک تأثیر قوی محیط روی بیان این ژن مشخص می­گردد (112). لوکوس ژنی HvCBL4 در جو با ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس همولوگ بوده و با HvNaX4 به طور همزمان تفرق می­یابد (112).  

تحمل به شوری در گیاهان می ­تواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT[1] باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یون­های سدیم یا انتقال یون­های سدیم و پتاسیم را تسهیل می­نماید (86 و132) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء می­ کند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT  (144) و در برنج 8 ژنHKT  (33 و 48) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده می­باشد (100) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((33، 48 و 72). اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.

محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (105). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل می­ کند، که این نتیجه ­گیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیت­هایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد می­یابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (88). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم می­ شود (150). همچنین گزارش شده است که خانواده­های ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت می­نمایند که این نشان دهنده اهمیت آن­ها در تحمل نسبت به شوری است (43). چند مکانیسم در سازگاری­های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسم­ها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی می­باشد (32 و 99). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (138). این فرایند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H+-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد می­گردد، تسریع می­ شود (31، 37، 62 و 145). افزایش فعالیت آنتی­ریپورتر Na+/H+ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشه ­های هوردئوم وولگار گزارش شده است (32). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (66 و 115). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT  دارای دو نقش می­باشند: 1- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و 2- کاهش تجمع یون سدیم در برگ­ها با انتقال آن­ها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آن­ها به داخل فضای آوند آبکش (113).

تکنیک اکوتیلینگ:

تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیت­های بزرگ یا مجموعه­های بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راه­حل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه می­باشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالی­های ژنی که از طریق برنامه ­های بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست می­آیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آن­ها نمی ­باشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژن­ها یا پروتئین­هایی که قبلاً خصوصیات آن­ها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوه­ای برای آن­ها در نظر گرفته نمی­ شود (11). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالی­های ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آن­ها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالی­ها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (64). با بهره گرفتن از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط می­گردد (17 و 46). اکوتیلینگ روشی است که با آن می­توان به سرعت و به سادگی پلی­مورفیسم­های طبیعی (پلی­مورفیسم­های تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافه­های کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (16). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون­ در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.)  (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.)  (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G)  (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند  (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با بهره گرفتن از این روش، تعیین آلل­های مختلف ژن­های هدف و کاهش تعداد نمونه­هایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکان­ پذیر می­ شود. معمول­ترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آلل­های نادری که فراوانی آن­ها کمتر از 5% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء می­نمایند. اثرات بسیار مؤثر آلل­های نادر روی صفات کمّی و بیماری­های پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (14 و 114). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئین­ها عملکرد ژن را تغییر می­ دهند (109).   

مزیت­های تکنیک اکوتیلینگ شامل موارد زیر است: 1- این تکنیک در همه گیاهان و جانوران، حتی گونه ­هایی که قادر به موتانت زایی نیستند، قابل کاربرد است (35)، 2- قابلیت تعیین تنوع در تعداد تکرار ستلایت­ها (SSRs) را دارد (139)، 3- قابلیت تعیین سطوح هتروزیگوسیتی در گونه­ های دگرگشن با هتروزیگوسیتی بالا را دارد (35) و 4- ظرفیت تشخیص پلی مورفیسم­های چند گانه در یک قطعه مجزا را دارد (139). مزایای تکنیکی روش اکوتیلینگ در مقایسه با سایر روش­های مولکولی به این دلیل است که روش­های ارزیابی بر اساس حرکت ژل، مانند الکتروفورز ژل گرادیانت (DGGE) و پلی مورفیسم­های تک رشته­ای (SSCP) قادر نیستند محل و نوع پلی مورفیسم در قطعه DNA را تعیین کنند (21). تکنیک­های دنیچره کردن و PCR نیز صرفاً برای قطعات کوچک DNA استفاده می­شوند و تکنیک مبتنی بر آرایه می ­تواند 50% از SNPها را بیابد و در این میان، روش توالی­یابی برای این منظور بسیار مناسب و دقیق می­باشد. این روش در گذشته برای ارزیابی جمعیت­های بسیار بزرگ پر هزینه بود اما امروزه با پیشرفت سریع در تکنیک­های توالی­یابی به عنوان روشی کم هزینه­تر و با راندمان بالاتر و همچنین استفاده از نرم افزارهایی که تجزیه و تحلیل داده ­های توالی­یابی را