فصل اول: مقدمه و كلیات

1-1- مقدمه و اهمیت موضوع…………………………………………………….. 2

1-2- تعریف مسئله…………………………………………………………………. 4

1-3- اهداف………………………………………………………………………….. 5

1-4- فرضیات………………………………………………………………………… 5

فصل دوم: بررسی منابع

2-1- غذاهای فراسودمند…………………………………………………………… 8

2-2- فراورده های غذایی فراسودمند حاوی میکروب‌های پروبیوتیک…………… 8

2-3- ماست پروبیوتیک……………………………………………………………… 9

2-4- پروبیوتیک‌ها…………………………………………………………………… 10

2-4-1- معیار انتخاب میکروارگانیسم به عنوان پروبیوتیک……………………… 11

2-4-2- اثرات سودمند پروبیوتیک‌ها……………………………………………….. 12

2-5- گونه‌های شناخته شده پروبیوتیک‌ها ……………………………………….14

2-5-1- گونه لاکتوباسیلوس پلانتاروم……………………………………………. 15

2-5-2- لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7………………………………………………

2-6- فرایند ریزپوشانی…………………………………………………………….. 16

2-6-1- ریزپوشانی پروبیوتیک‌ها…………………………………………………… 19

2-6-2- ساختمان ریزپوشینه………………………………………………………. 20

2-6-3- انواع روش‌های ریزپوشانی………………………………………………… 21

2-6-4- استفاده از روش امولسیون به منظور ریزپوشانی پروبیوتیک‌ها………. 23

2-6-5- کاربرد امولسیون‌های چند گانه در توسعه مواد غذایی سالم………… 25

2-6-6- کاربرد امولسیون دوگانه در ریزپوشانی میکروارگانیسم‌ها…………….. 26

2-6-7- سورفاکتانت‌ها…………………………………………………………….. 27

2-7- مواد مصرفی برای ریزپوشینه‌دار کردن……………………………………… 29

2-7-1- صمغ‌های ژلان و زانتان……………………………………………………. 29

2-7-2- ژلاتین………………………………………………………………………. 30

2-7-3- نشاسته…………………………………………………………………… 30

2-7-4- کاراگینان……………………………………………………………………30

2-7-5- سلولز استات فتالات……………………………………………………… 31

2-7-6- کیتوزان……………………………………………………………………… 31

2-7-8- آلژینات………………………………………………………………………. 31

2-7-9- صمغ فارسی………………………………………………………………. 32

2-8- مروری بر تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی بقاء باکتری‌های پروبیوتیک ریزپوشینه شده  طی نگهداری در ماست…..34

2-9- مروری بر تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی میزان بقاء باکتری‌های پروبیوتیک ریزپوشانی شده نسبت به شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی………….35

2-10- هدف از انجام پژوهش……………………………………………………. 37

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1- معرفی تجهیزات، موادو میکروارگانیسم‌های مورد استفاده……………. 40

3-1-1- تجهیزات مورد استفاده………………………………………………….. 40

3-1-2- مواد شیمیایی……………………………………………………………. 41

3-1-3- میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………….. 43

3-2- عملیات میکربی…………………………………………………………….. 44

3-2-1- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک………………………………. 44

3-2-2- آزمون‌های بیوشیمیایی به منظور شناسایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7

3-3- آنالیز شیمیایی شیرخشک بدون چربی  و صمغ فارسی………………. 46

3-3-1- اندازه‌گیری خاکستر……………………………………………………… 46

3-3-2- اندازه‌گیری رطوبت و ماده خشک………………………………………. 46

3-3-3- اندازه‌گیری چربی………………………………………………………… 47

3-3-3-1- روش سوسكله……………………………………………………….. 47

3-3-3-2- روش ژربر……………………………………………………………….. 47

3-3-4- اندازه‌گیری پروتئین و ازت کل………………………………………………47

3-3-5- اندازه‌گیری اسیدیته برحسب اسید لاكتیك…………………………….. 48

3-5- رسم منحنی رشد…………………………………………………………… 48

3-6- تهیه سوسپانسیون فعال سلولی جهت ریزپوشانی…………………….. 49

3-7- فرایندهای ریزپوشانی……………………………………………………….. 49

3-8- آنالیز رهایش سلول‌ها از ریزپوشینه‌ها……………………………………. 50

3-9- محاسبه‌ی بازده فرایند ریزپوشانی………………………………………… 50

3-10- بررسی مورفولوژی ریزپوشینه‌ها توسط میکروسکوپ  نور.ی………….. 51

3-11- تهیه‌ی ماست پروبیوتیک و ارزیابی خصوصیات میکروبیولوژیکی، فیزیکی و حسی نمونه‌های ماست…51

3-11-1- تهیه ماست پروبیوتیک……………………………………………………. 51

3-11-2- آزمون‌های انجام شده بر روی ماست…………………………………… 53

3-11-3- ارزیابی میزان بقا پروبیوتیک‌ها درطول دوره نگهداری ماست…………. 54

3-12- بررسی میزان بقاء سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده در محیط شبیه‌سازی شده گوارشی….54

3-13- آماده‌سازی عصاره‌های شبیه‌سازی شده گوارشی……………………… 55

3-14- ارزیابی پایداری سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی…..55

3-15- ارزیابی حسی……………………………………………………………….. 55

3-16- آنالیز آماری داده‌ها ……………………………………………………………56

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- آزمون‌های بیوشیمیایی………………………………………………………. 58

4-2- آزمون‌ها و بررسی‌های شیمیایی…………………………………………… 62

4-2-1- شیرخشک………………………………………………………………….. 62

4-2-2- صمغ فارسی………………………………………………………………… 63

4-3- منحنی رشد باکتری لاکتوباسیلوس پلانتارومA7……………………………

4-4- فرایندهای ریزپوشانی و پوشش‌دهی………………………………………. 65

4-4-1- شکل ریزپوشینه‌های تولید شده…………………………………………. 65

4-5- میزان بقاء سلول‌های ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در طی دوران نگهداری در دمای 4 درجه سانتی گراد…66

4-6- میزان بقا سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست در طول نگهداری….67

4-7- نتایج ارزیابی مقاومت سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست، قبل و بعد از افزودن به ماست در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی………70

4-8- ارزیابی آزمون های شیمیایی ماست طی زمان نگهداری……………. 74

4-8-1- تغییرات pH………………………………………………………………..

4-8-2- تغییرات اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک در نمونه‌های ماست…….. 75

4-9- ارزیابی آزمون‌های فیزیکی و کیفی  ماست طی زمان نگهداری……… 77

4-9-1- تغییرات گرانروی………………………………………………………….. 77

4-9-2- تغییرات سفتی و نفوذ ناپذیری بافت ماست…………………………… 78

4-10- ارزیابی خصوصیات حسی ماست………………………………………. 79

فصل پنجم: نتیجه‌گیری

5-1- جمع بندی نتایج کلی……………………………………………………… 82

5-2- پیشنهادات………………………………………………………………….. 83

منابع………………………………………………………………………………..86

چکیده:

تحقیقات نشان داده است که اکثر مواد‌غذایی پروبیوتیکی حتی زمانی که در دماهای پایین نگهداری می‌شوند تعداد پروبیوتیک‌های آن‌ ها کم می‌شود و این امر باعث می­ شود تعداد آنها در زمان مصرف کمتر از حد لازم باشند (CFU/g107). روش­های مختلفی برای افزایش مقاومت باکتری­ های حساس پروبیوتیک پیشنهاد شده که از آن جمله می‌توان به ریز‌پوشانی اشاره کرد. در تحقیق حاضر، سلول­های سویه­ی بومی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 که یک پروبیوتیک شناخته شده است، توسط صمغ فارسی و به روش امولسیون دوگانه پوشش داده شد و در بستر ماست اضافه شد. خصوصیات ظاهری این ریزپوشینه­ها توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرارداده شد. میزان بقاء این باکتری به دو صورت آزاد و پوشش داده شده با صمغ فارسی در بستر ماست و به صورت جداگانه در مدت 21 روز نگهداری در دمای 4 درجه سانتی ­گراد بررسی شد. طی این مدت تغییرات pH واسیدیته نمونه­ها، خواص حسی، ویسکوزیته و سفتی نمونه­­های  ماست حاوی سلول‌های پوشش داده شده و آزاد نیز مورد بررسی قرار گرفت. در انتهای دوره­ نگهداری مشخص شد که اثر ریزپوشانی بر زنده مانی باکتری­ ها معنی­دار بوده است (05/0p<). در نمونه­ حاوی میکروب ریزپوشانی شده با صمغ فارسی طی 21 روز انبارمانی در یخچال تنها 8/0 سیکل لگاریتمی از تعداد میکروب وارد شده کاهش پیدا کرده بود و تعداد هنوز بیشتر از CFU/g107 بود. در شرایط شبیه­سازی شده گوارش نیز اختلاف معناداری بین سلول ریزپوشینه و آزاد وجود داشت. pH و اسیدیته تمامی نمونه­ها تغییر معنی‌داری در روزهای اولیه داشت. میزان  ویسکوزیته در طول زمان نگهداری کاهش پیدا کرد و در همین مدت زمان، سفتی بافت افزایش پیدا کرد. خواص حسی نمونه ماست حاوی پروبیوتیک ریزپوشانی­شده دارای اختلاف معنی‌داری با نمونه شاهد بود. به طور کلی نتایج این پژوهش، روش امولسیون دوگانه و صمغ فارسی را پوشش دهنده­ مناسبی برای باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در بستر ماست معرفی کرد و مشخص شد که این روش می ­تواند از جمله راهکارهایی برای افزایش بقاء این باکتری در نظر گرفته شود.

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه و اهمیت موضوع

نقش ترکیبات فعال رژیم غذایی در تغذیه انسان، یکی از مهم­ترین مسائل مورد توجه و تحقیق در زمینه علم تغذیه است. یافته­ های پژوهشی در مورد این موضوع، پیامدهای گسترده­ای برای مصرف‌کنندگان، مسئولان بهداشتی، متخصصان تغذیه و هم­چنین تولیدکنندگان، فرایندکنندگان و توزیع­کنندگان موادغذایی داشته است. شواهد علمی جدید در مورد فواید و خطرات مرتبط با جنبه­ های منحصر به فرد ترکیبات رژیم­غذایی، به طور مداوم در حال ظهور و  پیشرفت می­باشند. اثرات بالقوه مواد مغذی و اجزای دیگر در رژیم­غذایی، منجر به تحقق ایده تولید مواد غذایی با ویژگی­های خاصی شده است که فراتر از برآوردن نیازهای اساسی تغذیه­ای، بر عملکرد بدن نیز مؤثر باشند. این عامل توجیه­کننده­ علاقه­ زیاد مردم به غذاهای فراسودمند[1] است (بورگاین و همکاران، 2006).

موادغذایی که به طور رضایت­بخشی باعث بهبود وضعیت سلامت و یا کاهش خطر ابتلا به بیماری­ها، می­شوند را غذاهای فراسودمند می نامند. این محصولات در حال حاضر، بازار رو به رشدی داشته و یکی از زمینه ­های اصلی فعالیت در تولید محصولات جدید است. از آن­جایی که مصرف‌کنندگان بیش از پیش به دنبال غذاهای سالم با ارزش­ بالاتری هستند، محصولات موفق­تر آنهایی هستند که می­توانند ادعا کنند دارای  فواید سلامتی­بخش بیشتری هستند. از آنجا که اثرات مفید مواد غذایی تابعی از ترکیبات فعال در رژیم غذایی (اجزای فراسودمندا) می­باشد، طراحی و توسعه این غذاها نیاز به روش­هایی برای تعریف و بهینه­سازی حضور آنها دارد،  چه با افزایش سهم ترکیبات اولیه با اثرات مفید و چه با محدود کردن ترکیباتی که دارای پیامدهای منفی برای سلامتی هستند.

از گذشته غذا نه تنها به عنوان عامل تامین­کننده انرِژی بدن انسان بوده است بلکه به عنوان عاملی برای افزایش سلامت مصرف ­کننده نیز، مورد استفاده قرار می­گرفته است. بنابراین، امروزه تحقیقات علم تغذیه، در مواردی از جمله دریافت بهینه مواد مغذی، شناسایی اجزای با کیفیت در ترکیبات موادغذایی و توسعه غذاهایی جدید با عملکرد جدید که همان نقش ترکیبات غذایی در پیشگیری از بیماری­ها با تعدیل سیستم­های فیزیولوژیکی است، توسعه یافته است.

اولین تعریف غذاهای فراسودمند را به بقراط نسبت می­ دهند با شعار غذا را داروی خود کنید (ریاض. م، 1999). بعد از آن اولین بار در سال 1980،  ژاپن  غذاهایی را که با هدف ارتقاء سلامت مصرف ­کننده تولید و فراوری می‌شد، فراسودمند نامید (شاه و همکاران، 2000). امروزه غذاهای فراسودمند به صورت زیر تعریف می­شوند، محصولات غذایی که علاوه بر ارزش تغذیه­ای معمول، مزایای خاص دیگری هم برای سلامتی دارند و یا غذاهایی که حاوی سطوحی از ترکیبات زیست فعال می­باشند که به ارزش غذایی معمول محصول اضافه می­ کنند (نازار و همکاران، 2009).

این روزها مردم علاقه به مصرف غذاهای سالم­تر، بدون تغییر اساسی در رژیم غذایی خود دارند. این بی­علاقگی مصرف­ کنندگان نسبت به تغییر عادات غذایی پیشنهاد می­دهد که بازار بالقوه­ای برای غذاهایی وجود دارد که ارزش تغذیه­ای آنها عوض شده است، ولی خواص حسی آنها تغییر نکرده است (ریاض و همکاران، ‌1999). علاوه بر این علاقه مردم به مصرف غذاها و یا مکمل­های غذایی که به بهبود میکروفلور روده کمک می­ کند، بیشتر شده است (ساندوال و همکاران، 2010). در این میان غذاهای پروبیوتیک مهم­ترین غذاهای ارتقاء دهنده سلامت مصرف ­کننده می­باشند و در سال­های اخیر آگاهی مردم نسبت به اینکه مصرف پروبیوتیک­ها اثرات مفیدی بر سلامتی دارد، افزایش یافته است (چمپاجن و همکاران، 2007). استفاده از پروبیوتیک­ها در غذاهای فراسودمند و صنایع دارویی رشد زیادی داشته است، به طوری­که 65 درصد از بازار غذاهای فراسودمند را به خود اختصاص داده‌اند (آگوست، 2006). موادغذایی نسبت به داروها حامل بهتری برای پروبیوتیک­ها محسوب می­شوند زیرا مصرف­ کنندگان تمایل بیشتری به مصرف غذاهای سودمند نسبت به داروها دارند و غذای پروبیوتیک ارزش غذایی بیشتری نسبت به داروی حاوی پروبیوتیک دارد.

باکتری­ های پروبیوتیک به این صورت تعریف می­شوند؛ میکروارگانیسم­های زنده­ی غیر بیماریزایی، که وقتی به مقدار کافی مصرف شوند اثرات مفیدی بر سلامت میزبان (که می ­تواند انسان یا دام باشد) خواهند داشت (دلا پورتا و همکاران، 2012؛ پیکوت و همکاران، 2000). امروزه محصولات پروبیوتیکی از قبیل سویا، آب­پرتقال، محصولاتی بر پایه­ غلات و حتی شکلات پروبیوتیک در بازار عرضه می­شوند (رودگرز. س، 2011).

عواملی موجب کاهش زنده­مانی پروبیوتیک­ها در موادغذایی می­باشند مثل pH نامطلوب، دما، پتانسیل اکسیداسیون – ­احیا و تولید هیدروژن پراکسید (چاواری و همکاران، 2010؛ آلان و همکاران، 2010)، در نتیجه در بسیاری از محصولات به هنگام مصرف تعداد باکتری به اندازه مطلوب باقی نمانده است. هم­چنین اسید معده و قلیای روده هم در زنده­مانی باکتری­ ها موثر است (کاپلا و همکاران، 2007). روش­های مختلفی برای افزایش مقاومت باکتری­ های پروبیوتیک حساس پیشنهاد شده از جمله آنها می­توان به انتخاب سویه­های مقاوم به اسید معده، استفاده از بسته­بندی غیر­قابل­نفوذ به اکسیژن یا استفاده از موادی که اکسیژن را مصرف می­ کنند مثل آسکوربیک اسید، ایجاد سازش با استرس، دو مرحله­ ای کردن تخمیر (اگر محصول تخمیری است)، الحاق باکتری به ریزمغذی­ها مثل اسیدهای آمینه و پپتید­ها و ریزپوشانی اشاره کرد (آلان و همکاران، 2010).

ریزپوشانی[2] فرایندی است که سلول­ها در شبکه ریزپوشینه یا در یک غشا قرار می­گیرند. یک ریزپوشینه شامل غشایی نفوذ ناپذیر یا نیمه نفوذپذیر، کروی، نازک و محکم است که اطراف هسته­ی مایع/جامد را پوشانده است که قطر آن بین یک میلی­متر تا چند میکرون متغیر است. پلیمر­های غذایی مثل آلژینات، کیتوزان، کربوکسی متیل سلولز، کاراگینان، ژلاتین و صمغ­ها از جمله صمغ فارسی و صمغ عربی به طور عمده و با روش­های مختلف در ریزپوشانی استفاده می­شوند. چون جمعیت سلول­ها طی فرایند ریزپوشانی تحت تاثیر قرار می­گیرد، ضروری است که اطمینان حاصل شود که تکنیک ریزپوشانی تاثیر منفی بر جمعیت سلولی ندارد.

یک روش جایگزین برای حفاظت از باکتری­ های پروبیوتیک وارد کردن آنها به امولسیون آب در روغن در آب است. امولسیون دوگانه احتمالا محافظ مناسبی برای باکتری­ ها هنگام عبور آنها از محیط معده است و به عنوان کپسولی زیستی[3] برای ریزپوشانی باکتری­ ها برای مصارف صنعتی در صنعت لبنیات استفاده می­ شود (گنزالس و همکاران).

2-1- تعریف مسئله

با توجه به نقش ریزپوشانی در افزایش بقاء میکروارگانیسم­ها، و با در نظر گرفتن اینکه محصولی پروبیوتیک است که به تعداد لازم ( cfu/ml107) به سلول­های اپیتلیال روده برسد، نشان از وجود لزوم پرداخت به این موضوع است و سوالات زیر در ذهن تداعی می­ شود:

1- آیا فرایند ریزپوشانی توسط زدو باعث حفظ و نگهداری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست می‌شود؟

2- آیا فرایند ریزپوشانی توسط زدو باعث حفظ و نگهداری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در محیط شبیه­سازی شده گوارشی می­ شود؟

3-1- اهداف

یکی از اهداف این تحقیق بررسی اثر محافظت­کننده­ ریزپوشینه­های آماده شده به روش امولسیونی آب در روغن در آب صمغ فارسی بر زنده­مانی باکتری پروبیوتیک  لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7[1] در بستر ماست و نگهداری امولسیون بدون اضافه کردن به ماست  در دمای C˚4 است. در این تحقیق برای اولین بار اثر محافظت­کنندگی ریزپوشینه­های تولید شده با بهره گرفتن از صمغ فارسی  بر زنده­مانی باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در بستر ماست و شرایط شبیه­سازی شده گوارشی مورد بررسی قرار گرفته است.

4-1- فرضیات

در این پروژه دو فرضیه مدنظر می­باشد:

1- ترکیباتی که به عنوان پوشش برای ریزپوشانی مورد استفاده قرار می­گیرند، می­توانند با محافظت از باکتری سبب افزایش مقاومت باکتری در ماست شوند.