1-41- جنبه جدید بودن و نوآوری در تحقیق. 4

5

2-1-آمیلاز  6

2-1-1- تاریخچه. 6

2-1-2- آمیلاز در تکامل انسان. 6

2-1-3- کارکردهای آمیلاز. 7

2-1-4- ساختار آمیلاز. 9

2-1-5- اندازه گیری سطح خونی. 9

2-2- آلفا آمیلاز  10

2-2-1-کارکرد آلفاآمیلاز. 11

2-2-2- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان. 12

2-3- آمیلاز بزاقی یا Ptyalin  12

2-3-1- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی. 12

2-4- آلفا آمیلاز پانکراس   13

13

2-5-1- تفسیر میزان آلفا آمیلاز. 13

2-6- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز  14

2-7- مطالعه فعالیت آنزیم  14

2-7-1- روش های اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی. 14

2-7-2 – روش های رنگ سنجی : 15

2-8- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain) 15

2-9- ژن های آلفا آمیلاز در انسان  16

2-10- آلفا آمیلاز در موش   18

2-10-1-تفاوت توالی انتهای 5 mRNA های آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی موش از لحاظ اندازه 19

2-10-2- مطالعات مربوط به آنالیز توالی mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20

2-10-3- خصوصیات  mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20

  21

. 22

. 22

23

24

24

24

25

25

25

26

فصل سوم  مواد و روشها 27

3-1- روش های اجرایی کار : 28

3-1-1- حیوان آزمایشگاهی مورد مطالعه : 28

3-1-1-1-دلایل انتخاب این حیوان به طور خلاصه عبارتند از : 28

3-1-1-2-شرایط نگه داری حیوانات : 28

3-1-2- نوع مطالعه  29

3-2- روش اجرای طرح (چاق کردن موش ها با بهره گرفتن از رژیم غذایی با چربی بالا) 29

. 30

3-2-2- جدا سازی کبد و خونگیری از قلب موش.. 30

3-3- استخراج RNA  34

3-3-1- وسایل کار استخراج  RNA. 34

3-3-2- مراحل استخراج    RNA.. 34

3-3-2-1-  رسوب دادن RNA : 35

3-3-2-2-  شستشوی RNA : 35

3-3-2-3-  خشك كردن رسوب RNA : 35

3-3-3-  ارزیابی كمی و كیفی RNA استخراج شده: 36

3-3-3-1-  اندازه گیری مقدار RNA : 36

3-3-3-3-  حفظ و نگهداری RNA: 37

3-4- بررسی بیان ژن  37

3-4-1-  RT-PCR. 37

3-4-2-  تکثیر cDNA. 39

39

 

 

43

3-4-2-3- روش انجام آزمایش ساخت  cDNA.. 44

3-4-2-4- نحوه انجام واكنش RT-PCR   برای اطمینان از صحت سنتز cDNA.. 45

3-4-2-5- آشکار سازی محصولات PCR با الکتروفورز. 47

3-4-2-6- دستگاه های مورد نیاز برای الکتروفورز. 47

347

3-4-2-8- نحوه انجام الکتروفورز. 48

3-4-2-9- آشکار سازی ژل. 48

3Real time PCR. 49

Real-time PCR. 49

Real time PCR. 50

Real-time PCR. 51

3-5-3-1- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR.. 51

. 52

53

Real time PCR. 55

Real time PCR. 55

3-5-6-2-روش انجام آزمایش Real time PCR. 55

3-5-6-3- آنالیز آماری  57

3-6-اندازه گیری α-Amylase در سرم موش: 57

 

3-6-2- اندازه گیری α-Amylase در سرم روش فتومتریک.. 57

فصل چهارم  نتایج.. 60

 

4-2- تعیین کیفیت و غلظت RNA استخراج شده 66

4-3- بررسی کیفیت cDNA سنتز شده به وسیله PCR  67

68

4-4-1- مقایسه بیان ژن liver alpha amylase در موش های چاق و نرمال. 70

4-4-2-اثر چای سبز بر بیان ژن liver alpha amylase بر روی موش های چاق. 71

4-5- اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک   72

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری   73

5-1- بحث و نتیجه گیری  74

5-2-پیشنهادات   8

منابع  83

خلاصه انگلیسی  92

 

عنوان                     فهرست جداول                            صفحه

   29

cDNA  44

cDNA  44

cDNA  45

  45

  46

Real time PCR. 55

Real time PCR. 56

  59

   61

  67

 

عنوان                                        فهرست نمودارها                                          صفحه

نمودار 3-1-فازهای مختلف واکنش تکثیر 51

نمودار 3-2-Cycle threshold&Threshold. 53

نمودار 3-3-منحنی ذوب   54

نمودار 3-4-مراحل مختلف انجام واکنش Real time PCR. 56

نمودار 4-1-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی  64

نمودار 4-2-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی  64

نمودار 4-3-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی  65

نمودار 4-4-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی  65

نمودار 4-5-منحنی تکثیرژن آلفا آمیلاز کبدی  69

نمودار 4-6-منحنی ذوب ژن آلفا آمیلاز کبدی  69

نمودار 4-7-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و کنترل عادی  70

نمودار 4-8-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و چاق کنترل  71

نمودار 4-9-تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق و نرمال بر حسب IU/ml به روش فتومتریك   72

 

عنوان                                       فهرست اشکال                                         صفحه

شکل2-1-نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است   11

شکل2-2-ساختار کریستالی آلفا آمیلاز جو ایزوآنزیم 1  16

شکل2-3-جایگاه ژن آمیلاز روی ژن 1p21  17

شکل2-4-این شکل تکامل ژن آمیلاز انسانی را نشان می دهد  19

شکل2-5-توالی ای که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین  mRAN آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی  20

شکل2-6-مقایسه شماتیکی از mRAN آلفا آمیلاز کبدی و بزاقی  21

شکل3-1-پلت آزمایشگاهی  30

شکل3-2-مراحل خونگیری از قلب موش   32

شکل3-3-مراحل جداسازی کبد موش   33

شکل3-4- غلظت مواد استفاده شده در Master mix استفاده شده در PCR  46

شکل3-5-اتصال SYBR به DNA  52

شکل4-1-تصویر باند حاصل از RNA استخراج شده 67

شکل4-2-صویر محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفی انتخاب شده بودند  68

 

چکیده:

مقدمه و اهداف

آلفا آمیلاز آنزیمی از راسته هیدرولازها است  که پیوندهای 1به4 آلفا گلیکوزیدی در پلی ساکاریدها را کاتالیز می کند و یکی از مهمترین آنزیم های گوارشی است. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز (مانند چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و  سندرم متابولیک  کمک نماید.

مواد و روش ها

موش ماده NMRI (6 هفته ای) به طور تصادفی به 4 گروه (8=n)تقسیم شدند. گروه اول  موش های نرمال بودند که تحت هیچ تیماری قرار نگرفته بودند. گروه دوم  موش های نرمال بودند که عصاره ی آبی الکلی چای سبز (به میزان 2/0 میلی گرم) مصرف کرده بودند. گروه سوم موش هایی بودند که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند وگروه چهارم موش هایی بودند که علاوه بر این که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند در این مدت از عصاره ی آبی الکلی چای سبز هم (به میزان 2/0 میلی گرم) دریافت کرده بودند. طی  8 هفته، در 4 گروه وزن بدن به صورت هفتگی اندازه گیری شدو پس از پایان دوره بافت کبدی جدا شده و بیان آلفا آمیلاز کبدی اندازه گیری شد. پس ازجداسازی RNA و سنتزcDNA،Real time -PCR با پرایمر اختصاصی برای ژن  Amy-1 ژن انجام شد.

نتایج

متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی در مقایسه با موش های کنترل عادی  افزایش یافته، و این افزایش از لحاظ آماری معنی دار است (P value≤0.01).همچنین متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق تیمار در مقایسه موش های چاق عادی کاهش یافته، واین کاهش هم از لحاظ آماری معنی دار است ( P value≤0.04). لذا می توان گفت مصرف هم زمان چای سبز با رژیم غذایی پر کالری اثر کاهنده بر روند افزایش بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی دارد.

واژه گان کلیدی : آلفا آمیلاز، کبد، بیان ژن، چاقی،چای سبز

فصل  اول:

 

کلیات

 

1-1-بیان مسئله

چاقی به عنوان یک خطر بزرگ برای سلامت انسان شناخته می شود. چاقی می تواند خطر ابتلا به بیماری های قلبی و عروقی (به طور عمده بیماری قلبی و سکته مغزی)، دیابت نوع 2، اختلالات اسکلتی عضلانی (به خصوص آرتروز) و