فهرست مطالب:

چکیده………………………………………………………………………. 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه………………………………………………………………… 3

1-2- بیان مسئله…………………………………………………………. 4

1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق……………………………………. 5

1-4- ادبیات تحقیق………………………………………………………. 6

1-5- اهداف تحقیق……………………………………………………… 10

1-5-1 اهدف کلی……………………………………………………….. 10

1-5-2 اهداف جزئی…………………………………………………….. 10

1-5-3 اهداف کاربردی………………………………………………….. 11

1-6- سؤالات تحقیق…………………………………………………… 11

فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- خلیج فارس……………………………………………………….. 13

2-2- استان بوشهر…………………………………………………….. 14

2-3- نفت و آلودگی‌های نفتی………………………………………… 15

2-4- ورود نفت به آب دریا………………………………………………. 17

2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا…………………………….. 17

2-5-1 پراکنده شدن…………………………………………………….. 18

2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب………………………….. 18

2-5-3 حل شدن………………………………………………………… 18

2-5-4 تبخیر شدن……………………………………………………… 18

2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی……………………………………. 18

2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن…………………………………….. 19

2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی………………………………………….. 19

2-5-8 ته نشین شدن………………………………………………… 19

2-6- تجزیه‌زیستی………………………………………………………20

2-7- معرفی هیدروکربن‌های آروماتیک………………………………. 20

2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک…………………………………. 20

2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک……………………………….. 21

2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی…………………………………… 22

2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک……………………………… 23

2-7-5 اثرات هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده….27

2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان……….. 27

2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا می‌کند؟……………………. 27

2-8- فنل……………………………………………………………….. 28

2-8-1 کلیات ترکیب فنل………………………………………………. 28

2-8-2 نام‌گذاری……………………………………………………….. 28

2-8-3 فنول‌های طبیعی……………………………………………… 29

2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی………………………. 29

2-8-5 خواص فیزیکی………………………………………………… 29

2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده…………………..30

2-8-7 کاربردها………………………………………………………… 30

2-9- تجزیه‌زیستی……………………………………………………. 30

2-9-1 روش‌های پاکسازی بیولوژیکی…………………………….. 31

2-9-2 مبانی زیست‌درمانی…………………………………………. 32

2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی…………………………………… 32

2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی………………………………. 32

2-9-5 مخمرها و قارچ‌ها……………………………………………… 33

2-9-6 استفاده از بیوراکتور‌ها……………………………………….. 33

2-9-7 کو‌متابولیسم………………………………………………….. 34

2-9-8 دی‌نیتریفیکاسیون……………………………………………..34

2-9-9 کمپوست کردن……………………………………………….. 34

2-9-10 درمان بیولوژیکی……………………………………………. 34

2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک……….35

2-11- مسیر های تجزیه زیستی………………………………….. 36

2-11-1 تجزیه میکروبی فنل…………………………………………. 36

2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین…………………………………….. 39

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

 

 

3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده……………………………… 44

3-1-1 محیط ONR7a………………………………………………….

3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار………………………………. 45

3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار……………………………………. 45

3-1-4 محیط مارین براث (MB)……………………………………….. 45

3-1-5 محیط مارین آگار (MA)………………………………………… 46

3-1-6 محیط نوترینت براث (NB)……………………………………… 46

3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA)……………………………………… 46

3-2- محلول‌ها………………………………………………………… 47

3-2-1 سرم فیزیولوژی……………………………………………….. 47

3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA)…………….. 47

3-2-3 محلول Tris-Base……………………………………………..

3-2-4 محلول TBE……………………………………………………

3-2-5 محلول   EDTA Tris-Base- (TE)……………………………

3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید……………………………………….. 48

3-3- مواد مصرف شده در PCR……………………………………..

3-4- دستگاه‌های مورد استفاده……………………………………. 49

3-5- روش عملی…………………………………………………….. 50

3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده…50

3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط…………………….. 51

3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف………………………….. 51

3-5-2-2 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده نفتالین……………….. 51

3-5-2-3 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل……………………. 51

3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده………………………… 51

3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده………..51

3-5-3-2 تست های تکمیلی………………………………………. 52

3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری………………………………….. 52

3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24)……………………… 52

3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل…………………………………….. 52

3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین………………………………….. 52

3-5-4 شناسایی باکتری ها………………………………………… 53

3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم……………. 53

3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده……………………….. 54

3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR……………….

3-5-4-4 بررسی محصول PCR……………………………………….

3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها…..55

 فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

4-1- نمونه برداری………………………………………………….. 57

4-2- شمارش باکتری ها…………………………………………… 58

4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها……………………………. 58

4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها…………………………. 60

4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین……………… 61

4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده……………… 62

4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل…..62

4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده نفتالین…..62

4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین…..63

4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین…63

4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24)……………………… 67

4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک……………………….. 71

4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین………………………………… 71

4-5-3-2 سنجش حذف فنل……………………………………… 73

4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک….75

4-6-1 بررسی محصول PCR………………………………………

4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها……………….. 76

4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها………………………… 92

4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها………………………………… 94

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث و نتیجه گیری…………………………………………… 97

5-2- پیشنهادات……………………………………………………. 100

منابع و مآخذ………………………………………………………… 101

فهرست منابع فارسی…………………………………………….. 101

فهرست منابع انگلیسی………………………………………….. 103

چکیده انگلیسی……………………………………………………. 108

چکیده:

ترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آن‌ ها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال 2013 بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌ های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روش‌های کاهش آلاینده‌های مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسم ها جهت پاکسازی این‌گونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتری‌های جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتری‌های جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمر‌های Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد 9 باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این تحقیق به وجود آلودگی به فنل و نفتالین در نوار ساحلی استان بوشهر و تفکیک منطقه‌ای هر باکتری انجامید. سپس با توجه به رسم درخت فیلوژنی و بررسی فاصله بین نمونه‌ها از صحت نتایج اطمینان حاصل شد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه

خلیج‌فارس به دلیل شرایط اقلیمی ویژه‌ی حاکم بر آن بسیار شکننده و آسیب‌پذیر است و ورود کمترین آلاینده‌ها به داخل دریا اثرات مخربی بر سلامت آبزیان و موجودات آن دارد. خلیج‌فارس با تمام مشکلات محیطی و اقلیمی که بر آن حاکم است از تنوع ژنی بالایی برخوردار است. از طرفی خلیج‌فارس محل حمل و نقل جهانی محسوب می‌شود و این امر موجب شده در سال‌های گذشته لکه‌های نفتی بسیاری از این نفت‌کش‌ها در آب‌های خلیج‌فارس به جا بماند, از طرفی آلاینده‌های صنایع حاشیه سواحل وارد آب این دریا         می‌شوند و همچنین بخشی از آلاینده‌ها بر اثر حرکت نفت‌کش‌ها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتی‌ها- حفاری و عملیات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ریختن زباله‌ها از داخل شناور‌ها به خلیج‌فارس تزریق می‌شوند. مرجان‌های زیبا و گونه‌های نادر گیاهی و جانوری در حالی قربانی توسعه بی رویه غیر اصولی و هجوم انواع آلاینده‌ها به درون دریا می‌شوند که هنوز سازمان حفاظت از محیط زیست به عنوان دستگاه متولی حفظ محیط زیست نتوانسته اقدام موثر و شایسته‌ای در این زمینه انجام دهد. که در نهایت اینگونه بی‌توجهی‌ها منجر به مرگ و میر آبزیان و مهاجرت آن‌ ها به خارج از منطقه, تغییرات در تنوع زیستی و کاهش تنوع زیستی و تغییر رفتار موجودات در محیط زیست منطقه می‌شود که از جمله آثار ناشی از آن آلودگی دریاهاست.

بخش اعظم آلاینده‌های موجود در خلیج‌فارس از نوع نفتی است, از طرفی نفت از میلیون‌ها ترکیب تشکیل شده است که در کل می‌توان آن‌ ها را در 4 دسته تقسیم‌بندی کرد که عبارتند از ترکیبات آروماتیک, هیدروکربن‌های اشباع, رزین‌ها و آسفالتن‌ها. از طرفی ترکیبات آروماتیک با توجه به تعداد حلقه‌های بنزنی به کار رفته در ساختارشان تقسیم‌بندی می‌شوند که در این پروژه از فنل بعنوان یک ترکیب آروماتیک تک حلقه و از نفتالین بعنوان یک ترکیب دو حلقه استفاده شده است. ترکیبات آروماتیک از طریق استنشاق, بلعیدن و تماس مستقیم با پوست قابلیت ورود به بدن داشته و در صورت بروز این رخداد منجر به بروز علایمی چون استفراغ, سرگیجه و اسهال می‌شود و با توجه به خصوصیات شیمیایی که دارا می‌باشند, توانایی ایجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و می‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در این پروژه با بررسی آلودگی منطقه ساحلی استان بوشهر به ترکیبات آروماتیک موفق به جداسازی و شناسایی 9 سویه تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک شده و با رسم درخت فیلوژنی به بررسی جد مشترک میکروارگانیسم‌ها پرداخته‌ایم. بطور کلی این پایان ‌نامه از 5 فصل تشکیل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کلیه قسمت‌های مربوط به پروپوزال جهت بیان مسئله و ارائه ضروریات اجرایی شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق. فصل سوم شامل روش اجرای تحقیق می‌باشد.در فصل چهارم به تجزیه و تحلیل داده‌ها پرداخته ودر نهایت در فصل پایانی به بحث و نتیجه‌گیری و بیان پیشنهادات می‌پردازیم.

2-1- بیان مسئله

تجزیه زیستی مواد، به فرایندی اطلاق می‌شود که در طی آن مواد آلوده‌کننده خارجی به وسیله میکروارگانیسم‌هایی که قادرند از آنها استفاده کنند، به مواد بی‌ضرر تبدیل می‌شوند (Luis and Mara et al 2000, 69-75; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496). که در آن از میکروب‌های مختلف استفاده می‌شود و اساس کار آن استفاده از جمعیت‌های میکروبی به منظور تجزیه آلاینده‌ها بوده بنابراین ضرورت نظافت زیستگاه‌های طبیعی جمعیت‌های میکروبی قبل از هر کار دیگر لازم و ضروری می‌باشد (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752). آلودگی نفتی از معضلات زیست محیطی می‌باشد، هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46) نفت‌خام کمپلکس پیچیده‌ای از مخلوط صد‌ها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربن‌ها, نیتروژن, گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربن شامل ترکیبات آروماتیک, آلیفاتیک و آسفالتی است (Sisler and Zobell 1987, 521-522; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496; Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) ورود هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای PAHs[1] به محیط زیست, اثرات بسیار خطرناکی در زندگی انسان خواهد داشت. مشخص شده است که PAH ها عوامل بالقوه سرطان‌زا برای انسان می‌باشند و به سرعت وارد بدن شده و در بافت‌های چربی بدن ذخیره می‌شوند (Koch and Fuchs 1992, 649-671). هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46). این آلاینده‌ها یکی از مهمترین آلودگی‌های زیست محیطی دنیا محسوب می‌شود که در اثر دفع و دور ریز نامناسب فاضلاب‌ها، ضایعات، پساب صنعتی و پخش آلاینده‌ها توسط نیروگاه‌ها و نشت آلاینده‌ها از مخازن نفت و ایستگاه سوختگیری و غیره وارد محیط زیست می‌شوند ((Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46; Cappello and Crisari et al. 2012, 39-50). استفاده از فعالیت‌های بیولوژیکی محیطی (باکتری‌های تجزیه کننده) در جهت حذف هیدرو‌کربن‌های نفتی که در این تحقیق ترکیبات آروماتیک می‌باشد نسبت به روش‌های فیزیکی (سوزاندن) که آلودگی زیست محیطی ایجاد می‌کند و روش شیمیایی (سورفکتانت‌ها) که روشی پر‌هزینه و دارای محدودیت می‌باشد مزیتی قابل توجه‌ای دارد (MacGillirray and Shiaris et al 1999, 90-101; Vinas and Grifoll et al 2002, 252-261; Moslemi and Vosoughi et al 2005, 15-23). میزان تجزیه و معدنی شدن ترکیبات آلی وابسته به غلظت ترکیبات است بطوریکه غلظت بالای هیدروکربن‌ها با محدود کردن مواد غذایی و اکسیژن یا از طریق اثرات