1-مقدمه………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-1- مقدمه‏ای بر مرکبات 2

1-2- تاریخچه‌ کشت درختان مرکبات در ایران و جهان 4

1-3- سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان .4

1-4- اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات …6

1-4-1- تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات .7

1-4-2- عامل بیماری 10

1-4-3- علایم و چرخه‌ی بیماری …13

1-4-4- ابزارهای ایجاد بیماری تحت اختیار باکتری ..14

1-4-5- جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه …14

1-4-6- سیستم‌های ترشحی باکتری 15

1-4-7- سیستم ترشحی نوع III (TTSS) 16

1-4-8- ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها …….17

1-4-9- هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ HR20

1-5- بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها 21

فصل دوم: مواد و روش‏ها

2- محل انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..25                                                                                                                                                                           25

2-1- مواد شیمیایی، آنزیم‏ها و کیت‏ها .25

2-2- سویه‏های باکتری ..25

2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده .26

2-4- محیط کشت باکتری‏ها …….26

2-5- آنتی‏بیوتیک‏ها …27

2-6- طراحی آغازگر .27

2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29

2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویه‏ی ..NIGEB.088(A*)31

2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده .31

2-10- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم‏هایTaq  و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‏های هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31

2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز …………33

2-12- خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز .33

2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز …34

2-14- هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ ..II35

2-15- الکتروفورز محصولات واکنش‏های هضم آنزیمی 39

2-16- واکنش اتصال .39

2-17- تکثیر پلاسمید ….42

2-18- اندازه‏گیری دانسیته نوری(OD) باکتری ..42

2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونی‏های نوترکیب 42

2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم (Mini-Preparation)43

2-21- توالی‏یابی …43

2-22- انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با‏ استفاده از روش ذوب و انجماد …43

فصل سوم: نتیجه‏گیری و بحث

3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47

3-1-  شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47

3-2-  شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS-  و Xac01 / Xac02……………………………….48

3-3-  استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49

3-4-  تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده 50

3-5- تکثیر ژن‏هایhrpW  و hrpG با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز .51

3-5-1-  طراحی آغازگرهای مناسب …51

3-5-2-  بهینه‏سازی شرایط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز 51

3-5-3-  الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز .53

3-6-  تایید ناقل‏های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54

3-7-  همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG  و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55

3-8-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57

3-8-1-  واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده 57

3-8-2-  تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G  در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی …58

3-8-3-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59

3-9- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59

 

3-10- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62

3-10-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده …62

3-10-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63

3-10-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز .64

3-11- توالی‏یابی ..65

3-11-1- نتایج توالی‏یابی ..66

3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.67

3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس ..67

3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67

فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها

4- جمع‏بندی کلی نتایج .70

4-1- پیشنهادها 71

پیوست

5- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84

5-1-  محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی 84

5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی …85

5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری 86

5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز .87

6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88

6-1- نمای ساده از دستگاه الكتروفورز 88

6-2- ژل آگارز .89

6-3- اتیدیوم بروماید ….89

6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز .90

6-5- طرز تهیه محلول .TBE 0.5X91

6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91

7- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92

7-1- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ..Bioneer92

7-2- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93

8- دستورالعمل تهیه باكتری‏های مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….95

8-1- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95

8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96

8-3- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و  pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با بهره گرفتن از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97

9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99

9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی …99

9-2- استخراج پلاسمید با بهره گرفتن از کیت MBST (دکتر شایان) …………….101

9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …X-Gal103

9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103

9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal) …103

10- تهیه مایه تلقیح و بهینه‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..103

 

فهرست جداول

1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات………………………………….       12

1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی………………………………………….     29

2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS-  و Xac01/Xac02………………………          30

3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری…………….         30

4-2- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq………………………….       32

5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز……….         32

6-2- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu………………………………………….      33

7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))…………….          36

8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)……………………..        36

9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)……………………………………………………………………………………………………………..     37

10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)……………………..        37

11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل……………………………………………………………………………………………………………………….    38

12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………. 38

13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)…………………………………………………………..         40

14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)……………………………………………………………       40

15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)…………………………………………………………….        41

16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)……………………………………………………         41

17-2- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی……………………………………………………………………………………………………………………..   45

18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی……………………………………………………………………………………     45

1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye………………………………………………     9

فهرست شکل‏ها

1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………48

2-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..49

3-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..50

4-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….53

5-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..53

6-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..54

7-3- هضم آنزیمی فراورده ژن‏هایhrpG  و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………55

8-3- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19  و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..55

9-3- واکنش کلونی PCR برای کلون‏های سفید حاصل ازhrpG  و hrpW……………………………………58

10-3- هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده از کلونی‏های حاصل از واکنش اتصال pGEM و hrpw و همچنینhrpG  و pUC19……………………………………………………………………………………………………..58

11-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز 1%….59

12-3- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..61

13-3- فراورده بازیابی شده ناقل بیانی و ژن‏های hrpW/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..62

14-3-  واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از مخلوط اتصال وکتور pBI121 و ژن‏های hrpG و hrpW……………………………………………………………………………………………………………………….63

15-3- هضم آنزیمی دوتایی پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG  و pBI.hrpW با آنزیم‏هایXbaI/BamHI XbaI/SacI……………………………………………………………………………………………………………………………..64

16-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG  و pBI.hrpW جهت بررسی حضور ژن‏های مذکور……………………………………………………………………………………………………………..65

17-3- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..66

18-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G  به          سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. 68

چکیده

بیماری شانکر به‏وسیله‏ی باکتری (Xanthomonas  citri pv. citri) ایجاد می‏شود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، به‏ویژه لیمو‏ترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش می‏دهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانه‏سازی دو ژن رمز کننده‏ی هارپین‏های HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW به‏منظور توسعه‏ی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژن‏ها با بهره گرفتن از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژن‏های تکثیر شده سپس به منظور همسانه‏سازی، در پلاسمید‏های pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژن‏های hrpW و hrpG،  با جایگاه‏های برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژن‏ها در گیاه، قطعه‏ی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاه‏های برشی برای ژن‏های هدف همسانه‏سازی شد، به‏طوری ‏که ژن‏های مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایان‏بر NOS در ناحیه‏ی  DNA T- این ناقل قرار گرفت. با بهره گرفتن از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، هضم آنزیمی و توالی‏یابی حضور ژن‏های هدف در کلونی‏های مثبت مورد تایید قرار گرفت. این ناقل‏های پلاسمیدی نوترکیب را می‏توان در انتقال ژن به گیاهان حساس به این بیماری مانند لیمو ترش و پرتقال با بهره گرفتن از آگروباکتریوم مورد استفاده قرار داد. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به سویه‏های مورد نظر آگروباکتریوم تومفاسینس منتقل و حضور ژن‏های مربوطه مورد تایید واقع شد. سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس تایید شده در برنامه‏های انتقال ژن مورد استفاده قرار خواهند گرفت.

 

1-      مقدمه
1-1-   مقدمه‏ای بر مرکبات
مرکبات با نام علمی Citrus spp. از خانواده‌ی Rutaceae و زیرخانواده‌ی Auranutideae هستند. مرکبات گیاهانی بوته‌ای، درختچه‌ای با شاخ و برگ متراکم می‏باشند، اغلب گونه‌های مرکبات (مانند پرتقال[1]، گریپ‌فروت[2] و دورگ‌های نارنگی[3]) در نواحی نیمه‌ گرمسیری با زمستان سرد فقط یک ‌بار در سال در اواخر زمستان و اوایل بهار گل می‌دهند. اما در نواحی گرمسیر و ساحلی ممکن است درختان مرکبات مانند لیموها[4] و لایم‌ها که در بهار و تابستان