کازئین­ها فسفوپروتئین­هایی هستند که 80 درصد پروتئین­های شیرگاو را تشکیل می­دهند. این پروتئین­ها  شامل انواع مختلف نظیرαS1 ، αS2، β و κ می­باشند.  اگرچه آلرژی­زایی این پروتئین­ها امروزه یکی از چالش های بزرگ علم پزشکی است، اما آن­ها به عنوان منبع غنی پپتیدهای فعال زیستی با فعالیت­های مختلف از جمله خاصیت آنتی­اکسیدانی و فعالیت ضد فشار خون می­باشند. در این پژوهش کازئین­بتا با بهره گرفتن از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی دی اتیل دی آمینواتیل-سلولز خالص شد. سپس کل کازئین­های شیرگاو و کازئین بتا به روش غیرآنزیمی و در شرایط احیایی قندی شد. نتایج آزمون جذبی اُ-فتالدئید و نشری فلورسامین حاکی از درصد بالای قندی شدن این پروتئین­ها در روش احیایی بود. مطالعه­ ساختاری کازئین­بتا با بهره گرفتن از دستگاه فلورسانس و دستگاه دورنگ­نمایی دورانی بیانگر تغییرات قابل توجه ساختار این پروتئین ضمن فرایند قندی شدن غیرآنزیمی بود. از منظر فعالیت چاپرونی دو کازئین­بتای قندی و غیرقندی تفاوت قابل ملاحظه­ای را نشان دادند. در این مطالعه پس از هضم ناقص این پروتئین­ها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین، خواص آنتی اکسیدانی، توانایی مهار آنزیم ACE و فعالیت آلرژی­زایی آن­ها و پپتید­های حاصل از هضم­شان بررسی شد. نتایج این پژوهش پیشنهاد می­ کند که در تمام موارد هم با قندی شدن هم طی هضم ناقص کازئین­ها فعالیت آنتی­اکسیدانی این پروتئین­ها تا حدودی بهبود می­یابد. نتایج این پژوهش پیشنهاد می­ کند که خاصیت آلرژی­زایی کازئین­بتا بعد از قندی شدن و هضم آنزیمی با آنزیم­ های فوق­الذکر به طور معنا داری تغییر نمی کند. همچنین نتایج این پژوهش نشان داد که فعالیت آلرژی­زایی تنها کازئین­های شیرگاو که با قند لاکتوز قندی شده بودند ضمن هضم ناقص با آنزیم کیموتریپسین کاهش می­یابد. همچنین مطالعه­ فعالیت مهاری آنزیم ACE پیشنهاد می­ کند که کازئین­بتای غیرقندی و محصولات پپتیدی حاصل از هضم آنزیمی ناقص آن نسبت به پروتئین­های قندی و محصولات هضم ناقص آنزیمی آن­ها خاصیت مهار آنزیم ACE بیشتری را دارد. در مجموع به منظور دستیابی محصولات هضمی کازئینی با توان آلرژی­زایی کمتر و خواص زیستی ارتقا یافته به مطالعات بیشتری همراه با تغییر شرایط آزمایشگاهی نظیر تغییر زمان هضم و یا تغییر نسبت پروتئاز به سوبسترای کازئینی ضروری به نظر می­آید.

واژگان کلیدی:

ساختار کازئین­بتا، فعالیت چاپرونی، فعالیت مهار آنزیم ACE، فعالیت آنتی­اکسیدانی، آلرژی­زای.

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل اول: مقدمه

1-1- شیر………………………………………………………………………………………………… 2

1-2- ترکیبات شیر………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-3- پروتئین­های شیر…………………………………………………………………………………………………………. 5

1-3-1- پروتئین­های آب پنیر………………………………………………………………………………………… 6

1-3-2- کازئین­ها…………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-3-3- کازئین­بتا…………………………………………………………………………………………………………….. 9

1-4- فعالیت­های زیستی کازئین­ها…………………………………………………………………………………….. 11

1-4-1- فعالیت چاپرون کازئین­های شیر…………………………………………………………………….. 11

1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی……………………………………………………………………………………. 12

1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………………………………. 12

1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………….. 12

1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12

1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12

1-4-2-3-2- فعالیت آنتی­اکسیدانی………………………………………………………………… 14

1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15

1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15

1-5-2- آلرژی به پروتئین­های شیر……………………………………………………………………………… 16

عنوان                                                                                                                      صفحه

1-5-2-1- معرفی انواع آزمون­های رایج جهت مطالعه­ فرایند آلرژی……………… 18

1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین­ها……………………………………………………………………………. 20

فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین………………………………………. 23

فصل سوم: مواد و روش­های تحقیق

3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27

3-2- تهیه­ محلول­ها……………………………………………………………………………. 28

3-2-1- تهیه­ محلول­های کازئینی، کازئین­بتا و تعیین غلظت آن­ها………………………. 28

3-2-2- تهیه­ محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با

 استفاده از کازئین­بتا……………………………………………………………………………. 28

3-2-3- تهیه­ محلول­های مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30

3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30

3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30

3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31

3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31

3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31

3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی­لیتر……………………………………………… 31

3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32

3-2-3-8- تهیه 100 میلی­لیتر محلول کوماسی­بلو……………………………………………… 33

3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33

3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلی­لیتر……………………………………………………. 33

3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34

 عنوان                                                                                                                      صفحه

3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35

3-2-7-  تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36

 

 

3-2-8- تهیه عصاره­ی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37

3-3-روش­ها………………………………………………………………………………………… 38

3-3-1- تخلیص کازئین­بتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38

3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39

3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با بهره گرفتن از SDS-PAGE…………………………… 40

3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40

3-3-5- قندی کردن کازئین­بتا و کازئین­های شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41

3-3-6- آزمون­های OPA و فلورسامین برای تایید فرایند

قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41

3-3-7- مطالعه­ فلورسانس ذاتی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………………. 42

3-3-8- مطالعه­ فلورسانس عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………….. 43

3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئین­های بتای قندی و غیرقندی،

با بهره گرفتن از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43

3-3-10- مطالعه­ فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………… 44

3-3-11- هضم کازئین­های شیرگاو و کازئین­بتای قندی و غیرقندی

به وسیله­ آنزیم­ های تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44

3-3-12- مطالعه­ فعالیت آنتی­اکسیدانی کازئین­های شیرگاو کازئین­بتای

 قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45

3-3-13- مطالعه­ فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ کازئین­بتا

 قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها……………………………………… 47

3-3-14- مطالعه­ توان آلرژی­زایی کازئین­ها و کازئین­بتای قندی

 و غیرقندی……. 47

عنوان                                                                                    صفحه

3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48

 فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت­های زیستی

(چاپرونی، آنتی­اکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژی­زایی کازئین­بتا………………………………. 50

4-1-1- تخلیص پروتئین کازئین­بتا………………………………………………………………………………. 50

4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51

4-1-3- مطالعه فرایند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا

در حضور ماده­ی احیا کننده………………………………………………… 52

4-1-3-1- مطالعه­ قندی شدن کازئین­بتا با بهره گرفتن از ترکیب OPA……………… 53

4-1-3-2- مطالعه فرایند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا با استفاده

 از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54

4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرایند

قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا……………………………………………………………………………… 55

4-1-4- مطالعه­ فلورسانس ذاتی و عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی…… 56

4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با استفاده

از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58

4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………………. 60

4-1-7- هضم آنزیمی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با آنزیم­ های

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62

4-1-7-1- تایید فرایند هضم آنزیمی با بهره گرفتن از ژلSDS-PAGE

(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63

عنوان                                                                                                                      صفحه

4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های بتای قندی

 و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………… 65

4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ کازئین­های

بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها………………………… 71

4-1-8- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای

حاصل از هضم آنزیمی آن­ها…………………………………………………………………………………………… 73

4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتی­اکسیدانی

 و آلرژی­زایی کازئین­های شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77

4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77

4-2-2- تایید فرایند قندی شدن کازئین­های شیرگاو……………………………………………….. 77

4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید

 قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77

4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعه­ قندی شدن غیرآنزیمی

کازئین­های شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78

4-2-3- هضم آنزیمی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیم­ های

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80

4-2-4- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو

 و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………………………………….. 82

4-2-5- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای

 حاصل از هضم آنزیمی آن­ها به وسیله­ دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

خلاصه­ی نتایج ………………………………………………………………………………. 90

 نتیجه ­گیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91

فهرست منابع و مآخذ       92

شیر

شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیم­ها و ویتامین­ها می­باشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)ی موجودات PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)دار ساخته می­ شود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز[1] نامیده می­ شود که سرشار از آنتی­بادی­هایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماری­ها را کاهش می­دهد. شیر به عنوان اولین ماده­ی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده می­ شود (Pehrsson، 2000).

شکل1-1- نمایی از ترکیبات موجود در شیر.

شیر نه تنها به عنوان یک ماده­ی غذای برای تغذیه­ی نوزاد تازه متولد شده مطرح است بلکه به عنوان یک ماده­ی غذایی ارزشمند و مغذی برای انسان در تمام کشورهای جهان استفاده می شود. امروزه در سراسر جهان دامداری­های بزرگ در سطح وسیع به تولید شیر و محصولات لبنی مشغولند به طوریکه در سال 2011 میزان تولید شیر در جهان 730 میلیون تن بوده است. هندوستان به عنوان بزرگترین کشور تولید و مصرف کننده شیر در جهان و نیوزلند، 28کشور عضو اتحادیه اروپا، استرالیا و ایالات متحده­ی آمریکا به عنوان بزرگترین صادر کننده های شیر و محصولات لبنی می­باشند. همچنین چین و روسیه به عنوان بزرگترین واردکنندگان شیر و محصولات لبنی در جهان شناخته می­شوند (Blasko، 2011).

 

1-2- ترکیبات شیر

همانطور که در بالا ذکر شد، شیر یک ماده­ی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات، چربی و ترکیبات معدنی است.  درصد، اندازه و نوع هر یک از ترکیبات تشکیل دهنده شیر بسته به گونه جاندار متفاوت است. به عنوان مثال درصد پروتئین شیر انسان نسبت به شیر گاو پایین­تراست در صورتی که درصد کربوهیدرات و چربی آن بالاتر می­باشد. شیر اسب و الاغ کمترین میزان چربی را در بین گونه­ های مختلف دارد. همچنین شیر انسان فاقد پروتئین بتالاکتوگلوبولین[2] است، درصورتی که این پروتئین یکی از پروتئین­های اصلی آب پنیر است و به مقدار قابل ملاحظه­ایی در شیرگاو دیده می­ شود. در جدول (1-1) درصد ترکیبات موجود در شیر برخی جانوران مشاهده می­ شود (Nelson و همکاران 1951 ، Barlowska و همکاران 2011).

جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد.

 

1-3- پروتئین­های شیر

اکثر پروتئین­های شیر در طول زمان شیردهی بوسیله­ سلول­های پوششی غدد PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)ی تولید و ترشح می­ شود. این سلول­ها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تری­آسیل گلیسرول[3] و دی­گلیسرول[4]) و کربوهیدرات (لاکتوز[5]) را نیز تولید و ترشح می­ کنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003).

پروتئین­های شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئین­ها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئین­های آب­پنیر (آلفالاکتالبومین[6]، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین[7] و ایمونوگلوبولین[8]) تقسیم می­شوند. کازئین­های شیر گاو 80 درصد و پروتئین­های آب­پنیر بین20 تا 45درصد کل پروتئین­های شیر انسان را تشکیل
می­ دهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996).

شکل1-2- پروتئین­های تشکیل دهنده شیرگاو.

1-3-1- پروتئین­های آب­پنیر