فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه

1-1- تولیدکنندگان برنج………………………………………………………. 2

1-2- کشت برنج در ایران…………………………………………………….. 2

1-3- متابولیت­های ثانویه درگیاهان…………………………………………… 3

1-4- تهیه نقشه­ های ژنتیک………………………………………………… 4

فصل دوم: کلیات و مرورمنابع

2-1- مشخصات گیاهشناسی برنج……………………………………….. 7

2-2- وضعیت ژنتیکی برنج…………………………………………………… 7

2-3- مهندسی تولید متابولیت­های ثانویه درگیاهان………………………. 8

2-4- ژن­های مسئول بیوسنتز فلاوونوئیدها و آنتوسیانین­ها……………….. 9

2-5- برنج رنگی……………………………………………………………… 11

2-6- نشانگرها در برنامه­ های اصلاحی………………………………….. 12

2-6-1- تعریف نشانگر………………………………………………………. 12

2-6-2- انواع نشانگرها…………………………………………………….. 13

2-6-2-1- نشانگرهای موفولوژیکی…………………………………………13

2-6-2-2- نشانگرهای سیتوژنتیکی………………………………………. 13

2-6-2-3- نشانگرهای بیوشیمیایی……………………………………… 14

2-6-2-4- نشانگرهای مولکولی…………………………………………… 14

2-6-2-4-1- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA……………………….

2-6-2-4-1-1- نشانگر­های مولکولی مبتنی بر هیبریداسیون…………… 15

2-6-2-4-1-2- نشانگر­های مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز..16

2-6-2-4-1-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR و هیبریداسیون….. 16

2-6-2-4-1-4- نشانگرهای مبتنی بر توالی­یابی (SNPها) و تراشه DNA….

2-7- کاربرد نشانگرهای مولکولی………………………………………. 17

2-8- انتخاب میان انواع مختلف نشانگرها…………………………….. 19

2-9- کاربرد نشانگرهای مولکولی در برنج……………………………… 19

2-10- انتخاب به کمک نشانگرها……………………………………….. 21

2-11- استفاده از نشانگرهای مولکولی درتهیه نقشه ژنتیکی……… 21

2- 12- ریزماهواره…………………………………………………………. 22

2-12-1- تشخیص آلل­های ریزماهواره……………………………………. 24

2-12-2- مزایای نشانگرهای ریزماهواره………………………………… 24

2-12-3- مشکلات کار با ریزماهواره…………………………………….. 25

2-12-3-1- اشتباهات آلل خوانی……………………………………….. 25

2-12-3-2- آلل­های صفر……………………………………………………. 26

2-12-3-3- اندازه نمونه مورد نیاز………………………………………… 26

2-12-4- ریزماهواره­ها درگیاهان و برنج………………………………….. 27

2-12-5- کاربردهای ریزماهواره…………………………………………… 28

2-13- نقشه­ های پیوستگی ژنتیکی…………………………………… 28

2-14- ویژگی­های نقشه…………………………………………………….. 29

2-15- سابقه نقشه یابی صفت رنگ دربرنج…………………………… 30

2-15-1- ارتباط بین رنگ پریکارپ وصفت گلوتیوز ………………………..33

2-15-2- توارث رنگ نوک دانه و ارتباط آن با صفات دیگر……………….. 33

2-15-3- روابط بین رنگ کلاله با صفات دیگر…………………………….. 34

2-15-4- ارتباطات بین رنگ پوشبرگ و صفات دیگر…………………….. 34

2-15-5- ارتباط بین رنگ کلاله و رنگ پوشبرگ…………………………. 35

2-15-6- ارتباط بین رنگ زبانک با صفات دیگر………………………….. 35

2-15-7- ارتباطات بین رنگ زبانک و رنگ پریکارپ……………………… 35

2-15-8- نشاندار کردن ژن­های مهم اقتصادی و انتخاب به کمک نشانگر (همراه)…36

2-15-9- مطالعه ژنتیکی و نشاندارکردن ژن صفت رنگ در برنج……… 37

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی…………………………………………………………. 41

3-1-1- رقم 18-33DN-……………………………………………………

3-1- 2- رقم ندا ……………………………………………………………42

3-2- کشت والدین و جمعیت F2…………………………………………

3-3- تهیه نمونه برگی…………………………………………………… 43

3-4- ارزیابی صفت……………………………………………………….. 44

3-5- استخراج DNA ………………………………………………………

3-5-1- روش استخراج DNA……………………………………………..

3-6- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده…………………… 49

3-6-1- ازطریق اسپکتروفتومتر…………………………………………. 49

3-6-2- به وسیله الکتروفورز ژل آگارز…………………………………… 49

3-7- بارگذاری نمونه­ ها و اجرای الکتروفورز…………………………… 50

3-8- آماده سازی آغازگرهای ریزماهواره……………………………… 51

3-9- انجام واکنش PCR………………………………………………….

3-10- تجزیه وتحلیل داده ها…………………………………………….. 54

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- ارزیابی فنوتیپی…………………………………………………… 57

4-2- ارزیابی مولکولی…………………………………………………… 58

4-2-1- غربال والدین……………………………………………………… 58

4-2-2- تحلیل لینکاژ ………………………………………………………60

4-3- ارزیابی نشانگر RM253 در ارقام دیگر برنج……………………… 64

فصل پنجم

پیشنهادات……………………………………………………………….. 68

منابع………………………………………………………………………..70

ضمائم

لیست پرایمرهای بکار رفته در پژوهش………………………………… 79

تهیه محلول­های مادری…………………………………………………… 81

ماتریس داده ­های مولکولی و فنوتیپی…………………………………. 83

چکیده:

وجود رنگدانه­ های آنتوسیانین در برنج عامل اصلی تولید پایه ساقه ارغوانی رنگ محـسوب می­ شود. رنگ پایه ساقه در برنج رابطه مستقیم و قوی با تشکیل دانه ­های رنگی در برنج دارد که در زیر پوسته آنها به دلیل تراکم متفاوت رنگیزه­های آنتوسیانین در لایه ­های مختلف پریکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگ­های سرخ، ارغوانی و سیاه مشاهده می­ شود. به منظور درک درست از مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین که اطلاعات مفیدی را در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک برنج به همراه خواهد داشت، الگوی تفرق ژن رنگ پایه ساقه با بهره گرفتن از تعداد 123 تک بوته از جمعیتF2  حاصل از تلاقی 18-33 – DN و ندا مورد مطالعه قرار گرفت.  ارزیابی تک بوته­ های  F2 بر اساس رنگ پایه ساقه نشان داد تعداد 83 بوته رنگی (ارغوانی) و تعداد 40 بوته بی­رنگ تولید شده نسبت تفرق 1 :075/2 را ایجاد می­نماید. آماره c2 این نسبت تفرق برابر 48/3 بود که از نسبت تفکیک  3:1 اختلاف معنی داری را نشان نداد (95/0p < ). در نتیجه ثابت شد که صفت مورد نظر از سیستم کنترل تک ژنی تبعیت می­نماید. مطالعات انجام شده با بهره گرفتن از 59 نشانگر مولکولی میکروساتلیت میزان 28 درصد چند شکلی بین والدین را نشان داد و آنالیز پیوستگی روی تک بوته­ های مغلوب جمعیت F2 از تلاقی ندا × 18-33 –   DNثابت کرد که ژن رنگ پایه ساقه بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 6 برنج با نشانگرRM253 که در فاصله 15 سانتی مورگان از ژن قرار دارد همبسته می باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- تولیدکنندگان برنج

برنج پس از گندم دومین غله مهم در دنیا به حسـاب می ­آید و به عنوان یکی از مهمترین محصولات استراتژیک جهان از اهمیت و جایگاه ویژه­ای برخوردار است، نزدیک به 90 درصد سطح زیر کشت و تولید برنج متعلق به کشورهای خاور دور می­باشد. بیش از نصف محصول برنج دنیا در دو کشور هند و چین تولید می­ شود. به طور کلی، کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری برمه، تایلند، ویتنام، لائوس، اندونزی، فیلیپین، پاکستان، هند، آمریکا، ژاپن، ایتالیا، مصر، چین، برزیل، کوبا، مکزیک و استرالیا از تولیدکنندگان عمده برنج به شمار می­آیند. میزان تولید برنج در تایلند، برمه، ویتنام و لائوس بیش از مصرف داخلی آنهاست و بنابراین نزدیک به 90 درصد برنج موجود در بازارهای دنیا متعلق به این 4 کشور می­باشد (53).

2-1- کشت برنج در ایران

کشت برنج در ایران در نواحی شمالی و در نواحی جنوبی به ویژه خوزستان تاریخچه طولانی دارد. شواهد نشان می­دهد که این محصول در این ناحیه، قرنها پیش از میلاد مسیح و در زمان هخامنشیان رواج داشته است. در ایران اسلامی نیز علی رغم دستاوردهای خوب تحقیقاتی و قریب به 600 هکتار زیر کشت برنج، متاسفانه به دلیل استفاده ناصحیح و توسعه محدود ارقام اصلاح شده و با توجه به رشد روز افزون جمعیت ایران، تولید داخلی برنج پاسخگوی نیاز مردم نیست و مقادیر قابل توجهی از خارج وارد می­ شود. افزایش تولید به دو روش افزیش سطح زیر کشـت و افزایش در واحد سطـح امـکان­پذیر می­باشد. بدلیل محدود بودن زمین­های زراعی و نیز کمبود شدید آب، بدون تردید باید تولید را در واحد سطح با بهره گرفتن از روش­های به­زراعی و به­نژادی افزایش داد. دستیابی به خودکفایی در تولید برنج و حفظ ثبات قیمت آن، از جمله اهداف مهم در کشورهای کم درآمدی است که برنج بعنوان تنها غذای اصلی، اساس تأمین نیازهای غذایی بوده و برای مردم فقیر و آسیب پذیر این کشورها شغل و درآمد ایجاد می­ نماید(53).

3-1- متابولیت­ های ثانویه در گیاهان

بعضی از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعی از ترکیبات موسوم به متابولیت­های ثانویه را تولید می­ کند. در مفهوم کلی، متابولیت­های ثانویه ترکیبات آلی هستند که نقش ضروری در رشد و نمو موجود زنده ندارند. با مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته است، به نظر می­رسد که متابولیت­های ثانویه به عنوان مواد طبیعی نقش اکولوژیکی مهمی در واکنش­های دفاعی گیاهان و همچنین گرده افشانی و انتشار دانه­ های گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند. بعضی از این ترکیبات به عنوان علف­کش و حشره کش در صنعت استفاده می­شوند در حالی که برخی دیگر کاربرد صنعتی ندارند. دسته بزرگی از متابولیت های ثانویه کاربرد دارویی و پزشکی دارند. ترکیبات دیگری از این گروه نیز نقش مهمی در تغذیه انسان و دام و كیفیت مواد غذایی (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند (72).

به دلیل كاربردهای فراوان، متابولیت­های ثانویه موضوع جالبی برای تحقیقات اصلاح نباتات از طریق روش­های مولكولی و مهندسی ژنتیـك محسـوب می­شوند. مطالعه در زمینه وظایف این تركیبات در گیاهان، یک موضوع جالب و مهم برای بسیاری از پروژه­ های تحقیقاتی شده است و نقش تعدادی از این تركیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است.

 در ده سال گذشته تحقیقات چندانی در ارتباط با متابولیت­های ثانویه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات اطلاعات اندك از مسیرهای تولید زیستی متابولیت­های ثانویه و برهم كنش آنزیم­ های درگیر در این مسیر همچنین اطلاعات محدودی از ژن­های مربوط به متابولیت­های ثانویه در دسترس است. یكی از مسیرهایی كه مطالعات بیشتری در سطح ژن­های دست اندركار آن نسبت به دیگر متابولیت­های ثانویه انجام شده است، مسیـر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیـانین­ها است (20). اكثـر ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین­ها همسانه­سازی شده و مطالعات فراوانی در سطح بیوشیمیایی، مولكولی و ژنتیک این دست از متابولیت­های ثانویه صورت گرفته است. یكی از مهمترین دلایل مطالعات بیشتر در این زمینه، آسانی بررسی این مواد از روی رنگ گل­ها، نوک دانه و پایه ساقه در گیاهانی همچون برنج است که بر اساس فنوتیپ قابل ارزیابی است (73). هدف از مهندسی ژنتیک مسیر یک متابولیت ثانویه، افزایش مقدار یک ماده خاص یا گروهی از تركیبات و یا حتی كاهش مقدار این تركیبات است. برای دستیابی به هدف دوم كه كاهش میزان تولید یک ماده خاص یا گروهی از مواد ناخواسته است، راه­های مختلفی وجود دارد. این مواد ممكن است تركیبات سمی در یک محصول گیاهی، مواد مانع خالص سازی یک فرآورده صنعتی یا موادی از این دست باشد. یكی از این راه­ها، مسدود كردن یک مرحله از مسیر تولید متابولیت ثانویه و مختل كردن تولید یا فعالیت آنزیم مربوط به آن مرحله است. این هدف می ­تواند با كاهش میزان mRNA مسئول تولید این آنزیم، با بهره گرفتن از فناوری آنتی­سنس، RNAi یا بیان بالای یک آنتی­بادی علیه آنزیم مسئول محقق شود. فناوری آنتی­سنس برای تغییر رنگ به طور گسترده­ای استفاده شده است. راه­های دیگر دستیابی به این هدف، تغییر مسیر به سوی مسیرهای موازی یا افزایش كاتابولیسم محصول نهایی است. اما ممكن است هدف از انجام تحقیقات، افزایش تولید یک تركیب خاص در گیاه بوده یا انتقال ژن­های مربوط به مسیر تولید یک متابولیت ثانویه به یک گیاه یا یک ریزسازواره مورد نظر باشد. همچنین ممكن است تولید یک ماده جدید كه به صورت طبیعی در گیاهان تولید نشود هدف یک پروژه تولیدی- پژوهشی باشد. در بـرخی روش­ها با تغییر میزان بیان یک یا چند ژن، بر موانع تولید یک ماده غلبه می كنند و در روش های دیگر، با حذف مسیرهای موازی (رقابتی) یا كاهش كاتابولیسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گیاه می­افزایند. ایجاد تغییراتی در بیان ژن­های تنظیمی كه كنترل مسیر تولید زیستی متابولیت­های ثانویه را برعهده دارند نیز از جمله روش­های افزایش یا كاهش تولید تركیب مورد نظر است.

4-1- تهیه نقشه های ژنتیک

ریشه بسیاری از محدودیت­های روش­های مختلف اصلاح نباتات، نبود زیر بنا و مقدمات ضروری اساسی برای مطالعات ژنتیک است. یکی از اجزای کلیدی و زیر بنایی و ابزار اساسی مورد نیاز برنامه-های آینده اصلاح نباتات، تهیه نقشه­های ژنتیک است. شاید یکی از مهم­ترین کاربرد نشانگرهای DNA تهیه نقشه-های ژنتیک باشد که براساس آن می­توان جایگاه ژنی و کروموزومی ژن­های تعیین کننده صفات مطلوب (ترتیب و فاصله ژن­ها و نشانگرها از یکدیگر بر روی کروموزوم ها) را تعیین کرد.

با دانستن جایگاه یک ژن روی نقشه ژنتیک، می­توان از نشانگرهای مجاور آن برای احراز جود یک صفت متناظر استفاده کرد. بدین ترتیب نیازی به انتظار برای ظهور آثار ژن نیست. با بهره گرفتن از نشانگرهای DNA می توان صفات و مشخصات آینده یک نشای برنج را پیش بینی کرد. در نتیجه تاثیری مثبتی بر اصلاح و پیشبرد گیاه دارد.

هدف از این پژوهش، مطالعه ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه در ژنوم برنج و شناسایی جایگاه­ ژنومی آن از طریق مارکرهای همبسته و ارزیابی نشانگرهای مولکولی ریزماهواره در شناسایی ارقام دارای ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه می­باشد. این مطالعه پیش نیاز مطالعات مولکولی بوده و مواد اصلاحی با ارزشی را برای آنها از طریق شناسایی نشانگرهای مولکولی همبسته با ژن فراهم می­آورد.