فهرست مطالب:

چکیده……………………………………………………………………………….. 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه…………………………………………………………………………. 3

1-2- هدف از انجام این تحقیق……………………………………………………. 5

1-3- پیگمان های میکروبی……………………………………………………….. 5

1-3-1 تعریف پیگمان های میکروبی……………………………………………… 5

1-3-2 تقسیم بندی پیگمان ها…………………………………………………… 6

1-3-2-1 ریبوفلاوین…………………………………………………………………. 6

1-3-2-2 کانتاگزانتین……………………………………………………………….. 6

1-3-2-3 کارتنوئیدها……………………………………………………………….. 6

1-3-2-4 پرودیجیوسین…………………………………………………………….. 7

1-3-2-5 فیکوسیانین………………………………………………………………. 7

1-3-2-6 ویولاسئین………………………………………………………………… 7

1-3-2-7 آستاگزانتین………………………………………………………………. 7

1-3-3 فاکتورهای موثر در تولید پیگمان میکروبی………………………………. 8

1-3-3-1 دما………………………………………………………………………… 8

1-3-3-2 pH…………………………………………………………………………

1-3-3-3 منبع کربن……………………………………………………………….. 8

1-3-3-4 منبع نیتروژن…………………………………………………………….. 8

1-3-3-5 نوع تخمیر………………………………………………………………… 8

1-3-3-6 مواد معدنی……………………………………………………………… 8

1-3-4 پایداری پیگمان های میکروبی…………………………………………… 9

1-3-5 میکروب های مولد پیگمان……………………………………………….. 9

1-3-5-1 باکتری ها……………………………………………………………….. 9

1-3-5-2 قارچ ها………………………………………………………………… 10

1-3-5-3 گلسنگ ها……………………………………………………………. 11

1-3-5-4 مخمرها………………………………………………………………… 11

1-3-5-5 جلبک ها……………………………………………………………….. 11

1-3-6 کاربردهای پیگمان های میکروبی……………………………………… 12

1-3-6-1 داروسازی………………………………………………………………. 12

1-3-6-2 مواد غذایی……………………………………………………………. 14

1-3-6-3 پزشکی……………………………………………………………….. 14

1-3-6-4 دیگر کاربردها………………………………………………………….. 15

1-4- تعریف SPF…………………………………………………………………

1-4-1 ضریب یا عیار حفاظتی………………………………………………… 18

1-4-2 حداقل مقدار اشعه ماورا بنفش ایجاد کننده قرمزی پوست (MED)…18

1-4-3 ضریب یاعیار حفاظتی میانگین……………………………………….. 19

1-4-4 ضریب یا عیار حفاظتی برچسب………………………………………. 19

1-4-5 ضریب حفاظتی آزمون شده (Test)…………………………………… 19

1-5- کاربرد و مزایای کرمهای ضد آفتاب………………………………………. 19

فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- پیشینه تحقیقات انجام شده…………………………………………… 22

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1- تجهیزات و مواد مورد نیاز………………………………………………… 27

3-1-1 تجهیزات دستگاهی……………………………………………………. 27

3-2- مواد………………………………………………………………………… 28

3-3- اجزاء محیط های کشت مورد استفاده و روش های تهیه آنها…………28

3-3-1 محیط کشت TSA……………………………………………………….

3-3-2 محیط کشت water agar………………………………………………

3-3-3 محیط کشت PDA………………………………………………………

3-3-4 محیط کشت YGC(yeast extract chloramphenicol agar)………..

3-4- نمونه گیری……………………………………………………………… 29

3-4-1 نمونه گیری از هوا و کشت نمونه…………………………………… 29

3-4-2 نمونه گیری از خاک و کشت نمونه …………………………………  30

3-4-3 نمونه گیری از آب و کشت نمونه……………………………………. 30

3-4-4 نمونه های گرفته شده از سطح برگ و گل و کشت آنها…………..31

3-4-5 نمونه برداری از گلسنگ های استان کرمان………………………. 31

3-5- خالص سازی باکتری ها و قارچ های جدا سازی شده در مراحل غربالگری…..31

3-6- نگهداری سویه های قارچی و باکتریایی……………………………. 31

3-6-1 نگهداری کوتاه مدت…………………………………………………. 31

3-6-2 نگهداری طولانی مدت جدایه های قارچی و باکتریایی……………31

3-7- ارزیابی تولید پیگمان توسط جدایه ها………………………………. 32

3-7-1 جدایه های قارچی………………………………………………….. 32

3-7-2 جدایه های باکتریایی……………………………………………….. 32

3-8- استخراج پیگمان از توده های زیستی مورد مطالعه بدست آمده در مرحله غربالگری…32

3-9- آماده سازی محلولی از پیگمانهای تهیه شده برای تهیه طیف اسپکتروفتومتریمورد نظر برای آنالیزهای دستگاهی…33

3-10- خشک کردن پیگمان های محلول………………………………… 34

3-10-1 خشک کردن در انجماد و سرما (لیوفیلیزاسیون)……………….34

3-10-2 خشک کردن در دمای محیط……………………………………. 34

3-11- ارزیابی جذب اشعه ماوراءبنفش توسط محلول های رنگی تهیه شده از پیگمان های بدست آمده در مرحله غربالگری….35

3-11-1 محاسبه فاکتور محافظت در مقابل اشعه ماوراء بنفش(SPF)…35

3-12- شناسایی جدایه های قارچی مولد پیگمان های دارای توانایی جذب حداکثر اشعه ماوراء بنفش…36

3-12-1 گسترش مرطوب (wet preparation)………………………….. 37

3-12-2 تکنیک چسب نواری شفاف…………………………………….. 37

3-12-3 تکنیک کشت روی لام (اسلاید کالچر)………………………….. 37

3-13- تعیین هویت بیوشیمیایی سویه باکتریایی مورد نظر…………….38

3-14- تعیین هویت مولکولی سویه باکتریایی و قارچی مورد نظر……..38

فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

4-1- نتایج کشت نمونه های هوا……………………………………….. 40

4-2- نتایج کشت نمونه های خاک……………………………………… 42

4-3- نتایج کشت نمونه های آب………………………………………… 43

4-4- نتایج کشت نمونه های گرفته شده از سطح برگ و گل…………..44

4-5- نتایج خالص سازی باکتری ها و قارچ های جدا سازی شده در مرحله غربالگری….45

4-6- ارزیابی موثر بودن روش های نگهداری سویه های بدست آمده در مرحله غربالگری در زنده ماندن جدایه های مورد نظر…46

4-7- نتایج ارزیابی روش های میکروسکوپی در شناسایی جدایه های قارچی…46

4-8- نتایج ارزیابی های بیوشیمیایی در جدایه باکتریایی مورد نظر…51

4-9- نتایج ارزیابی ملکولی جدایه باکتری های مورد نظر……………..51

4-10- نتایج ارزیابی تولید پیگمان توسط جدایه ها……………………. 52

4-11- نتایج آماده سازی پیگمان های مورد نظر برای اندازه گیری توانایی جذب اشعة u.v (تعیین فاکتور spf)…52

4-12- نتایج خشک کردن نمونه ها در روش های خشک کردن در انجماد (لیوفیلیزاسیون) و تبخیر در دمای 37 درجه سانتی گراد…52

4-13- نتایج استخراج پیگمان از توده های زیستی جدایه های بدست آمده در مرحله غربالگری…54

4-14- ارزیابی تعیین فاکتور SPF پیگمانهای مورد نظر……………….. 57

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1- بحث…………………………………………………………………. 59

5-2- پیشنهادات………………………………………………………….. 63

منابع و مآخذ………………………………………………………………. 64

فهرست منابع فارسی…………………………………………………… 64

فهرست منابع انگلیسی………………………………………………… 65

چکیده انگلیسی…………………………………………………………..71

چکیده:

بیشترین پیگمان­های طبیعی امروزه از گیاهان و جانوران استخراج می­شوند. امروزه توجه محققان به  پیگمان­های میکروبی معطوف شده است، زیرا این دست از پیگمان­ها طبیعی بوده و کاربردهای دارویی، صنعتی، غذایی و آرایشی بهداشتی دارند. تولید پیگمان توسط میکروارگانیسم­ها نسبت به منابع دیگر با اهمیت بوده زیرا میکروارگانیسم­ها رشد سریع داشته، استخراج رنگدانه از آن­ها راحت­تر بوده، تولید آن­ها وابستگی به شرایط جوی و خصوصیات جغرافیایی نداشته و همچنین از تنوع بالایی برخوردار بوده و تولید آن­ها قابل کنترل بوده و محصول نهایی آن­ها نیز قابل پیش بینی است. هدف از پروژه حاضر ارزیابی برون تنی جذب اشعه ماورای بنفش پیگمان­های میکروبی و تعیینSPF  آنها بوده است در این مطالعه پیگمان­های استخراج شده از گلسنگ توسط آمونیاک و پیگمان­های میکروب­های بدست آمده در مرحله غربالگری توسط حلال­های آب، DMSO بعد از جداسازی و خشک کردن در حلال­های مورد نظر حل شده و در 3 غلظت مختلف جذب آن­ها در طول موج­های بین محدوده 200 تا 700 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت و فاکتور محافظت از نور خورشید (SPF) در خصوص آنها محاسبه گردید نتایج نشان می­دهد که در بین نمونه­های مورد مطالعه پنج کپک، سه گلسنگ و یک باکتری در جذب uv کارایی خوبی داشته و از بین آنها یک باکتری و 2 کپک دارای فاکتور SPF به ترتیب 7، 272 و 140 بوده که متعلق به جنس­های باسیل گرم منفی غیرتخمیری (عدم تعیین هویت) و پنی سیلیوم و آسپرژیلوس بوده ­اند.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه

علم بیوتکنولوژی، مجموعه ­ای از متون و روش­ها است که برای تولید، تغییر و اصلاح فرآورده ­ها، به نژادی گیاهان و جانوران و تولید میکروارگانیسم­ها برای کاربردهای ویژه از ارگانیسم­های زنده استفاده      می­ شود. کاربرد بیوتکنولوژی در پزشکی به وسعت علم پزشکی بوده و حتی این علم با سرعت روز افزون به وسعت و دامنه علم پزشکی می­افزاید. از مهمترین کاربردهای بیوتکنولوژی در پزشکی می­توان به موارد تأثیر دگرگون بخش در امر درمان بیماری­های عفونی، ژنتیکی، سوء تغذیه و متابولیسم و نازائی، پزشکی قانونی و تأثیر دگرگون بخش در پزشکی زیبایی اشاره کرد (ملک زاده 1380، 75).

باکتری­ های پیگمان دار از جمله باکتری­ هایی هستند که قادر به سنتز پیگمان بعنوان یک متابولیت ثانویه می­باشند. در مقایسه با سویه­­های بدون پیگمان خود، تفاوت­هایی را از نظر مقاومت نسبت به عوامل فیزیکی و شیمیایی از خود نشان می­دهند. بسیاری از رنگدانه­ هایی که امروزه در روند تولید مواد غذایی، مواد رنگی، آرایشی بکار می- روند، گرایشی جهانی نسبت به تولید رنگدانه از منابع طبیعی ایجاد شده است.       رنگدانه­ های طبیعی از دو منبع مهم گیاهان و میکروارگانیسم­ها حاصل می­شوند. تولید رنگدانه توسط میکروارگانیسم­ها نسبت به منابع دیگر بسیار اهمیت دارد زیرا میکروارگانیسم­ها با رشد سریع، بازدهی بالاتر و استخراج راحت­تر، عدم وابستگی به شرایط جوی و گستردگی تنوع رنگ بیشتر نسبت به سایر منابع زیستی دارای مزایای بیشتری است. در این تحقیق اثرجذب اشعه ماورای بنفش پیگمان­های  میکروارگانیسم­ها که می توانند در فرآورده ­های ضدآفتاب کاربرد داشته باشد مورد بررسی قرار گرفته است (Joshi 2003, 1302-1306).

فرآورده ­های ضد آفتاب حاوی ترکیباتی هستند که از پوست در برابر اشعه مضر آفتاب (بعنوان مثال اشعه UV) حفاظت می­ کند.

سه نوع تابش UV خورشید وجود دارد:

الف-UVA: تابش اشعه­ی فرابنفش با طول موج nm400-320 که شامل 2 نوع می­باشد: UVA1 (nm 400تا340) و UVA2 (nm 340 تا 320) که از سطح فوقانی پوست (تا سطح درم) نفوذ می­ کند و نتیجه آن آسیب رساندن به لایه ­های زیرین پوست می­باشد. این تابش سبب پیری زودرس پوست، زبر شدن، لکه دار شدن، فرو رفتگی، چین و چروک پوست شده و در پیشرفت سرطان پوست سهیم است.

ب- UVB: تابش اشعه ماورای بنفش با طول موج nm 320 تا 290 که تنها تا قسمت اپیدرم نفوذ      می­ کند و سبب سوختگی و سرطان پوست می­گردد و پیک آن از بخش پایانی صبح تا اواسط بعد از ظهر می­باشد. تابش UVB مانع از فعالیت RNA , DNA و سنتز پروتئین می­گردد و موجب ظهور آثاری از قبیل التهاب، قرمز شدن و سوختگی پوست می­ شود. از طول موج­های بالاتر از nm 310 باعث تیره شدن رنگدانه­ها می­گردد.

ج- UVC: تابش فرابنفش در محدوده طول موج nm 290 تا 200 که توسط لایه ازون بلوکه می­ شود و به سطح زمین نمی­رسد. این بخش از تابش UVمورد توجه سازندگان فرآورده ­های ضد آفتاب نمی ­باشد (Burmeister and Brooks 1996, 49-53)،(Francis, Mark et al. 1998, 243-256)،(Holloway 1992, 229-234; Hemminki and Dong 2000, 647-651; Jansen 2001, 1012-1023; Robinson 2005, 1541-1543; Hader and Kumar et al. 2007, 267–285; Narayanan and Rao et al. 2010, 978-986). 

تنها پرتوهای UVB , UVAهستند که به استراتوسفر ازون نفوذ می­ کنند و به سطح زمین می­رسند. بیش از 95% از این پرتوها در ردیف UVA قرار دارند، هدف اغلب ضد آفتاب­ها این پرتوها هستند.

با وجود این پرتوهای UVBبیشترین سرطان زایی را بر سلول­های پوستی دارند. میزان مواجهه با UVA سالن­ها و تخت­ها برنزه سازی بیشتر از مقداری است که از نور طبیعی خورشید ساطع می­ شود. شیشه­های معمولی مانع ورود UVB می­ شود ولی تنها 50% از تابش UVA را غربال می­ کند. پوشش ابر، تنها به میزان 40% – 20% حفاظت در مقابل تابش UV ایجاد می­ کند به همین دلیل است که توصیه می­ شود حتی در روزهای ابری در خارج از منزل از ضد آفتاب استفاده شود. اشعه UVB در 65% از همه سرطان­های پوست نقش دارد(Beasley and Meyer 2010, 413-421) (Arora and Attwood 2009, 703-712; Narayanan, Rao et al. 2010, 978-986)

هر سال حدود یک میلیون نفر تشخیص داده شده که مبتلا به سرطان پوست هستند و حدود 10.000 نفر ملانوم بدخیم پوستی دارند. بیشترین سرطان پوست در نقاط مختلف بدن در اثر مواجهه با آفتاب مانند به صورت، گردن، سر و پشت دست­ها می­باشد. اثرات مضر تابش خورشیدی عمدتاً از منطقه­ اشعه ماورای بنفش (UV) می­باشد (SAX 2000, 48-50; Hawk, Young et al. 2004).

محافظت از آفتاب در هر سنی خطر کراتوز اکتینیک و سرطان سلول سنگ فرشی و پیشرفت تغییرات سنی مرتبط با نور را کاهش می­دهد (Stulberg 2003, 1955-1960)، (Stern 2004, 1526-1534) و(Mcintyre 2007, 667-671).

در کانادا نور خورشید آنقدر قوی است که باعث تشدید پیری زودرس در پوست و ایجاد سرطان پوست می­ شود. پرتوهای ماورای بنفش می­توانند از ابرها، مه، گرد و غبار عبور کنند. آب و شن و ماسه، سیمان و مخصوصاً برف می­توانند پرتوهای سوزاننده آفتاب را منعکس کنند و حتی افزایش دهند. این بدان معنی است که در زمستان هم نیاز به محافظت در برابر آفتاب داریم.

امروزه احتمال ابتلا به سرطان پوست بسیار بیشتر از آن چیزی است که 20 سال پیش بود. دلیل اصلی نحوه زندگی ما در خارج از خانه و صرف زمان بیشتر در بیرون می­باشد. امروزه در معرض پرتوهای ماورای بنفش نسبتاً قوی­تر قرار داریم چون لایه محافظتی اوزون که گرداگرد زمین را فرا گرفته است بخاطر اثرات آلاینده­ها و مواد شیمیایی نازک ترشده است. تعداد مبتلایان به سرطان پوست رو به افزایش است. این تعداد از سال 1990 تاکنون حدود 66% افزایش داشته است. لازم به ذکر است که محدودهUVC با توجه به تخریب لایه اوزون در برخی مناطق نیز از اهمیت ویژه ای برخوردار است(Hawk, Young et al. 2004)، (Narayanan Rao et al. 2010, 978-986) ، (Arora and Attwood 2009, 703-712) و (SAX 2000, 48-50).